人類Boule基因在減數(shù)分裂時(shí)期的生物信息學(xué)分析

孫洋洋，馬玉珍，石晶瑜

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010000;2.內(nèi)蒙古醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010000)

在精子發(fā)生這一復(fù)雜的生理過程中，減數(shù)分裂時(shí)期顯得尤為重要。染色體的復(fù)制、分離，基因突變和缺失都可能使精子發(fā)生異常，進(jìn)而導(dǎo)致男性不育。在與男性不育［1］相關(guān)的眾多調(diào)控因子當(dāng)中，DAZ家族就是其中非常重要的調(diào)控因子。它包括三個(gè)基因成員:DAZ、DAZL、Boule。DAZ 位于 Y 染色體上［2］，主要在靈長類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)該基因;DAZL(Deleted in azoospermia-like)位于常染色體，在哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物中存在;Boule［3］基因也是位于常染色體上，在線蟲、哺乳動(dòng)物、果蠅及脊椎動(dòng)物中存在，并且在第一次減數(shù)分裂時(shí)期高表達(dá)。Boule是一個(gè)高度保守的基因，它編碼精子發(fā)生減數(shù)分裂所需要的RNA結(jié)合蛋白。Boule基因全序列為編碼區(qū)起始于序列的118，終止于322，存在CpG島，長度為205bp。編碼區(qū)兩側(cè)為254bp的5’非翻譯區(qū)和308bp的3’非翻譯區(qū)，在3’末端的polyA尾上游處有一個(gè)加尾信號(hào)AATAAA。Kostova［4］發(fā)現(xiàn) Boule在睪丸組織中特異性表達(dá)的三個(gè)轉(zhuǎn)錄剪接體，其N末端又由三個(gè)選擇性剪接外顯子編碼。盡管調(diào)節(jié)精子發(fā)生的基因發(fā)生著迅速的進(jìn)化，但是從昆蟲到人類的Boule基因仍維持著保守的功能域［5］，果蠅的Boule突變會(huì)使精子發(fā)生在減數(shù)分裂時(shí)期受阻從而導(dǎo)致雄性不育。Eugene Yu jun Xu［5］等人在因 Boule缺失或突變導(dǎo)致的雄性不育蒼蠅睪丸中導(dǎo)入人的Boule基因轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)雄性不育果蠅能產(chǎn)生正常的精子。人類與果蠅Boule基因相似的功能表明人的Boule基因與果蠅的Boule基因直系同源，并且在調(diào)節(jié)減數(shù)分裂上，它在人類中的功能很可能與果蠅類似。人類精子發(fā)生過程中，減數(shù)分裂M期的起始是受M期啟動(dòng)因子MPF控制的，而MPF由細(xì)胞周期蛋白B和CDC2(Cell division cycle 2)組成。這個(gè)復(fù)合物是恢復(fù)減數(shù)分裂必需的，其活性受可逆磷酸化的調(diào)控，Wee1和 Myt1激酶使其磷酸化可致其失活，而CDC25磷酸酶可以使其活化，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換的完成［6］。目前已發(fā)現(xiàn)3種人類CDC25基因，其中CDC25A在睪丸中高表達(dá)，對(duì)精子發(fā)生至關(guān)重要［7］，特別是在初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)，與Boule蛋白的初始表達(dá)階段一致。在Boule缺乏的患者中，CDC25A磷酸酶基因mRNA仍然表達(dá)，有的甚至出現(xiàn)上調(diào)，但并沒有翻譯成具有功能的蛋白，而CDC25A磷酸酶的缺乏可能導(dǎo)致MPF超磷酸化，使MPF完全失活，這可能是患者精子發(fā)生阻滯的主要原因，Boule和CDC25A同時(shí)缺乏的患者減數(shù)分裂發(fā)生阻滯。Boule基因在哺乳動(dòng)物其它組織器官中的功能，尤其是它在精子發(fā)生中的所起的作用尚不完全清楚［9］，但Boule是精子生成所不可缺少的一個(gè)基因，它的表達(dá)在精子發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。

1 材料及其方法

1.1 材料

人 (Homo sapiens，AF272858)、斑 胸 草 雀(Taeniopygia guttata，XM－004175306.1)、虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss，HQ696915)、曼氏裂體吸蟲(Schistosoma mansoni，XP－002575519.1)、擬南芥(Arabidopsis thaliana，NM－111126.3)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster，NM－079265)、小鼠(Mus musculus， AF272859)、牛 (BosTaurus， NM－001102115)、松鼠猴 (Saimiri sciureus，AJ717408)、倭黑猩猩(Pan paniscus，AJ717405)等10種Boule基因的mRNA序列及其相應(yīng)的氨基酸序列，均來自美國國家生物信息中心(NCBI，National center for biotechnology information) 網(wǎng) 址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。物種分類如圖1所示。

圖1 10個(gè)物種的分類圖Fig.1 The ten species investigated in this study

1.2 方法及其使用的軟件

1.2.1 Boule基因的mRNA序列和蛋白序列分析

通過NCBI網(wǎng)站的Gene數(shù)據(jù)庫、Nucleotide數(shù)據(jù)庫和Protein數(shù)據(jù)庫查詢?nèi)?、家蠶等10種Boule基因的mRNA序列、氨基酸序列，基因所在的染色體及其蛋白質(zhì)質(zhì)量。

1.2.2 Boule蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析

利用 EBI(網(wǎng)址:http://www.ebi.ac.uk)網(wǎng)站的Clustalw Omega(網(wǎng)址:http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，對(duì)10種動(dòng)物的Boule蛋白的氨基酸序列做比對(duì)分析。

1.2.3 Boule蛋白分子進(jìn)化分析

利用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.05(Molecular evolutionary genetics analysis)對(duì)10種動(dòng)物的全長Boule蛋白做序列比對(duì)分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹采用鄰接算法，自檢舉5 000次，采用泊松校驗(yàn)計(jì)算距離。

1.2.4 Boule蛋白的氨基酸的理化性質(zhì)分析

利用 Expasy(網(wǎng)址 http://www.expasy.org/)的ProtParam工具 (網(wǎng) 址:http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)人的Boule蛋白氨基酸序列的相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)(PI)、不穩(wěn)定系數(shù)等物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.5 疏水性/親水性的預(yù)測(cè)和分析

利用Expasy網(wǎng)站的protscle(網(wǎng)址:http://web.expasy.org/protscale/)在線分析工具對(duì)人類Boule基因編碼的蛋白氨基酸序列的疏水性親水性進(jìn)行分析。所有的參數(shù)按照軟件的默認(rèn)值。

1.2.6 信號(hào)肽分析

對(duì)人類Boule蛋白氨基酸序列，利用在線分析工具SignalP 4.0 Server(網(wǎng)址:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析該氨基酸序列的信號(hào)肽的存在位置及序列。

1.2.7 跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

跨膜結(jié)構(gòu)域常常是由跨膜蛋白的效應(yīng)區(qū)域所展現(xiàn)，一般由20個(gè)左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α－螺旋。利用在線工具TMHMM Server v.2.0(網(wǎng) 址: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)人類Boule蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析。

1.2.8 卷曲螺旋域分析

在很多的天然蛋白質(zhì)中，都存在卷曲螺旋，該結(jié)構(gòu)具有重要的生物學(xué)功能，比如分子識(shí)別、運(yùn)動(dòng)和調(diào)控代謝等。利用在線分析工具COILS(http://www.ch.embnet.org/software/COILS－form.html)對(duì) Boule蛋白進(jìn)行卷曲螺旋域分析。

1.2.9 亞細(xì)胞定位分析

利用在線亞細(xì)胞定位工具TargetP－1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)，輸入Boule基因編碼的蛋白序列，在序列來源選擇Nonplant，其它選項(xiàng)用默認(rèn)值，確認(rèn)Boule基因編碼的蛋白主要在細(xì)胞中發(fā)揮作用的部位。然后再用PSORTⅡserver(http://psort.hgc.jp/form2.html/) 工具進(jìn)一步分析來驗(yàn)證上述工具分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.10 與Boule蛋白相互作用的蛋白分析

在STRING數(shù)據(jù)庫中(http://string－db.org/)查詢與Boule蛋白相關(guān)作用的蛋白。主要研究與Boule蛋白直接或者間接作用的相關(guān)蛋白。之所以研究其蛋白之間的相互作用關(guān)系，是因?yàn)榭梢酝ㄟ^與其相關(guān)蛋白的功能信息，了解和預(yù)測(cè)該蛋白的功能及其它信息。

1.2.11 Boule蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用基于 GOR算法的 GOR4(http://npsapbil.ibcp.fr/cgi－ bin/npsa－automat.plpage=npsagor4.html)在線工具預(yù)測(cè)該蛋白是否具模體、無規(guī)則卷曲、β轉(zhuǎn)角、β折疊及α螺旋等結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步用PredictProtein軟件對(duì)Boule的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.12 Boule蛋白的功能域預(yù)測(cè)和分析

分析蛋白質(zhì)的組成及其中所包含的功能域是了解蛋白質(zhì)功能的重要一步。蛋白質(zhì)中的功能域是參加蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)構(gòu)和功能單位。利用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.janelia.org/search/) 檢測(cè)蛋白功能域的組成，主要對(duì)其進(jìn)化過程中的高度保守的特異性區(qū)域進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 Boule基因的mRNA序列和蛋白序列分析

從NCBI網(wǎng)站相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫中得到10種動(dòng)物的全長Boule蛋白序列和 mRNA序列(見表1)。不同動(dòng)物Boule基因的蛋白質(zhì)大小不同，位于常染色體上。曼氏裂體吸蟲的Boule蛋白最大，為509 aa;虹鱒魚最小，為194 aa;小鼠的 Boule蛋白是297 aa;人、松鼠猴、倭黑猩猩的Boule蛋白質(zhì)大小相等，均為283 aa;牛的Boule蛋白大小是295 aa;黑腹果蠅的Boule蛋白大小為228 aa;野豬則為293 aa。

表1 10種不同動(dòng)物Boule基因查詢信息Table 1 Information of Boule genes in 10 different animals

2.2 Boule蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析

對(duì)10種動(dòng)物的Boule蛋白氨基酸序列做比對(duì)分析(見表2)。哺乳動(dòng)物類人、鼠、牛、松鼠猴、倭黑猩猩之間的Boule蛋白序列的相似度很高，在90% ～99%之間。其中人與倭黑猩猩的Boule蛋白相似度很高，高達(dá)99%。哺乳動(dòng)物與其它類動(dòng)物Boule蛋白序列的相識(shí)度比較低，在31% ～52%之間，其中哺乳動(dòng)物與黑腹果蠅的Boule蛋白序列相似度為31%～37%之間。曼氏裂體吸蟲與擬南芥Boule蛋白序列相似度最低僅為1%，表明了Boule基因在進(jìn)化中其功能的高度保守性。

表2 不同物種的Boule蛋白全長序列多序列比對(duì)的結(jié)果Table 2 Mutiple sequence alignment of Boule protein in different animals

2.3 Boule蛋白分子進(jìn)化分析

由分子進(jìn)化圖(見圖2)中可以看出，Boule蛋白在這10個(gè)物種中，主要分為兩大類。擬南芥獨(dú)自一類，其它9個(gè)物種為一大類;在哺乳動(dòng)物中，很明顯的又分為兩類，小鼠、牛、松鼠猴為一類，人、黑猩猩為一類并且親緣關(guān)系也最近。鳥類，魚類與哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系也比較近。

2.4 Boule蛋白的氨基酸的理化性質(zhì)分析

Boule蛋白分析表明:Boule蛋白含有283個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為31 299.86 Daltons，含量最豐富的氨基酸為 Pro、Ser、Val等(見表 3)。

2.5 疏水性/親水性的預(yù)測(cè)和分析

蛋白質(zhì)能夠折疊，主要因?yàn)槠渚哂杏H水性/疏水性的氨基酸。對(duì)其疏水性和親水性進(jìn)行分析可以更好地了解蛋白質(zhì)。該蛋白的疏水區(qū)共有9處(圖3)，分別為 33～36，38～40，123～128，167～169，171～173，205 ～207，232 ～234，237～238，265 ～267。親水區(qū)共有15處，分別為5～8，18～19，21～25，29～30，42～54，57 ～59，69 ～72，81 ～91，94 ～104，108 ～111，114 ～116，135 ～142，157～161，176 ～199，241 ～252。其中第168位最高，值為1.733;第98位最低，值為－2.622。P氨基酸分值最高表明其疏水性最強(qiáng)，Y氨基酸分值最低表明其親水性最強(qiáng)?？v觀Boule蛋白，氨基酸序列存在明顯的親水區(qū)和疏水區(qū)。

圖2 用鄰接法(NJ)構(gòu)建的10種動(dòng)物Boule蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Boule protein sequence from 10 different animals

表3 boule蛋白的氨基酸理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of boule protein

2.6 信號(hào)肽分析

在核糖體合成蛋白后，往往需要到達(dá)細(xì)胞中制定的位置才能發(fā)揮其功能。而蛋白能否到達(dá)細(xì)胞中的特定位置，則完全由信號(hào)肽進(jìn)行引導(dǎo)。經(jīng)SingnalP 4.0預(yù)測(cè)Boule蛋白的信號(hào)肽序列，結(jié)果見圖4。由圖4可知，Boule蛋白不存在信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白質(zhì)。與 PredictProtein數(shù)據(jù)庫(http://www.predicprotein.org)分析的結(jié)果一樣。

圖3 Boule蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophobicity/phydrophilicity prediction of the Boule protein

圖4 Boule蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.4 Signal peptide prediction of the Boule protein

2.7 跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

用在線工具TMHMM－2.0對(duì)Boule蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析如圖所示(見圖5)，結(jié)果表明Boule蛋白跨膜的可能性為0，所以Boule蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白質(zhì)類。

圖5 Boule蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)Fig.5 Transmembrane domain prediction of the Boule protein

2.8 卷曲螺旋分析

卷曲螺旋存在于很多天然的蛋白質(zhì)當(dāng)中，由圖6所示，在窗口為14和21的時(shí)候，在75～100處可能形成卷曲螺旋。

圖6 Boule蛋白的卷曲螺旋預(yù)測(cè)Fig.6 Coiled － coil prediction of the Boule protein

2.9 細(xì)胞定位分析

如圖7所示，Boule蛋白基本上排除了在分泌途徑上的功能，與信號(hào)肽分析的結(jié)果一致。與日本的PSORTⅡserver圖8比較，Boule蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體內(nèi)表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，Boule蛋白在第一次減數(shù)分裂(前中期)的生殖細(xì)胞中表達(dá)，從細(xì)線期精母細(xì)胞(Leptotene spermatocytes)開始表達(dá)，到偶線期精母細(xì)胞(Zygotene spermatocytes)表達(dá)量增加，在粗線期精母細(xì)胞(Pachytene spermatocytes)表達(dá)量達(dá)到最高水平，到雙線期(Diplotene)表達(dá)量顯著下降，在圓形精子細(xì)胞(Round spermatids)、長形精子細(xì)胞(Elongating spermatids)等精子發(fā)生更高級(jí)階段的細(xì)胞中Boule不表達(dá)，在胚胎早期、原始生殖細(xì)胞(Primordialgerm cells)和精原細(xì)胞(Spermatogonial cells)中均未檢測(cè)到Boule蛋白的表達(dá)［9］，Boule蛋白在細(xì)胞質(zhì)中特異表達(dá)在細(xì)胞核或接近減數(shù)分裂的染色體中未見表達(dá)。人類精子發(fā)生過程中，減數(shù)分裂M期的啟始受減數(shù)分裂啟動(dòng)因子MPF控制，而MPF是一個(gè)由細(xì)胞周期蛋白 B和Cdc2(Cell division cycle 2)組成的復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物對(duì)減數(shù)分裂的恢復(fù)是必需的，其活性受可逆磷酸化的調(diào)控，Wee1和Myt1激酶使MPF磷酸化可致其失活，而Cdc25磷酸酶可以使MPF活化，誘導(dǎo)G2/M轉(zhuǎn)換的完成。

圖7 Boule蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization prediction of Boule protein

圖8 Boule蛋白的細(xì)胞定位Fig.8 Cellular localization prediction of Boule protein

2.10 與Boule蛋白相互作用蛋白分析

每一種蛋白質(zhì)并不是孤立地存在于細(xì)胞中，而是與其他蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合體或功能模塊，從而在細(xì)胞中進(jìn)行各種不同的生理活動(dòng)(見圖9)。在果蠅中，PUM2蛋白與 Boule蛋白相互作用［10］。Boule激活并調(diào)控CDC25A的表達(dá)并且促進(jìn)CDC25AmRNA的翻譯，CDC25A蛋白進(jìn)一步促使MPF中的Cdc2磷酸化，激活促成熟因子(Maturation－promoting factor，MPF)，活化的MPF啟動(dòng)減數(shù)分裂過程G2PM的轉(zhuǎn)換，完成減數(shù)分裂過程。Boule蛋白的缺失或突變可能導(dǎo)致雄性不育。

圖9 Boule蛋白相互作用的蛋白分析Fig.9 Analysis of protein interaction with Boule

2.11 Boule蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

該蛋白由 9.19% α－螺旋(Alpha helix)、22.26%延伸鏈(Extended strand)和68.55%無規(guī)則卷曲(Random coil)所組成。進(jìn)一步用PredictProtein軟件對(duì)Boule的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，螺旋=7.4%，股=8.8%，環(huán)=83.7%，非正規(guī)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū):92－283(見圖10)。

圖10 Boule蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Secondary structure prediction of the Boule protein

2.12 Boule蛋白的功能域預(yù)測(cè)和分析

在35位點(diǎn)開始，106位點(diǎn)結(jié)束，存在RRM(RNA recognition motif)保守域(見圖11)，說明Boule基因在哺乳動(dòng)物中具有RRM基序、編碼RNA結(jié)合蛋白的特性［11］。

圖11 Boule蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.11 Predicted the structure domain of Boule protein

RRM是RNA結(jié)合蛋白中廣泛存在的一種保守結(jié)構(gòu)，它存在很多不同的RNA結(jié)合蛋白中，如異質(zhì)性核糖蛋白(Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins(hnRNPs))，在RRM基序中含有許多保守的氨基酸以保證對(duì)RNA的結(jié)合活性，但是這一家族的不同蛋白質(zhì)卻能特異地結(jié)合各種不同的RNA分子。

另外，運(yùn)行blastp程序服務(wù)器對(duì)Boule蛋白進(jìn)行搜索，得到圖12。從圖中看到，Boule蛋白屬于RRM(RNA recognition motif)超家族，具有與 COG0724，PABP-1234，PLN03134，SF-CC1，U2AF_1g，ELAV_HUD_SF，half_pint，hnRNP-R-Q 相似的保守域。

圖12 Boule蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.12 Predicted domain site of Boule protein

3 討論

Boule是果蠅、哺乳動(dòng)物不育和雄性生殖細(xì)胞在阻滯在減數(shù)分裂時(shí)期的一個(gè)高度保守的關(guān)鍵調(diào)控因子。在與精子發(fā)生障礙相關(guān)的不育病人當(dāng)中，Boule蛋白的表達(dá)顯著的下降。Boule是DAZ家族的一個(gè)成員，存在于靈長動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和后生動(dòng)物中。在果蠅中，研究表明，Boule表達(dá)在第一次減數(shù)分裂時(shí)期，調(diào)節(jié)Twine(phosphatase of Cdc25)的表達(dá)并開始促進(jìn)成熟細(xì)胞因子(initiate MPF)，比如Cdc2/cyclin B復(fù)合物，這些都是G2－M轉(zhuǎn)換和第一次減數(shù)分裂時(shí)期的關(guān)鍵因子。所以在果蠅中，Boule調(diào)節(jié)Twine來控制減數(shù)分裂。調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞的通路似乎很大程度上是保守的。本文對(duì)Boule基因及其編碼蛋白信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、結(jié)構(gòu)域及同其它物種的蛋白相似度同源比對(duì)等進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，該蛋白無信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu)是親水性蛋白，在75～100處可能形成卷曲螺旋。二級(jí)結(jié)構(gòu)以α－螺旋為主。具有RRM功能域。Boule蛋白的同源性分析證明了Boule功能在動(dòng)物中是高度保守的［12］。大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明Boule在精子形成減數(shù)分裂時(shí)期具有重要的調(diào)節(jié)作用。Xu等人發(fā)現(xiàn)Boule僅僅在精子發(fā)生時(shí)是必需的，但是在雌性的Boule基因缺失或者突變的時(shí)候仍可以正常生育。

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