• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織肥胖抑制素mRNA表達的影響※

    2013-11-14 11:03:54蔡欣蕊錢衛(wèi)斌錢秋海郭春芳姜群群
    河北中醫(yī) 2013年12期
    關鍵詞:灌胃小劑量空白對照

    蔡欣蕊 錢衛(wèi)斌 錢秋海 郭春芳 姜群群

    (山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院2012級博士研究生,山東 濟南 250014)

    實驗研究

    糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織肥胖抑制素mRNA表達的影響※

    蔡欣蕊 錢衛(wèi)斌1錢秋?!鞴悍?姜群群3

    (山東中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院2012級博士研究生,山東 濟南 250014)

    【摘 要】目的觀察中藥組方糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織肥胖抑制素(Obestatin) mRNA表達的影響并探討其機制。方法將60只雄性SD大鼠用鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高脂飲食制造糖尿病模型大鼠,選取40只隨機分為模型對照組、西藥對照組、糖脈通小劑量組、糖脈通大劑量組4組,每組各10只;另取10只正常大鼠為空白對照組。模型對照組以0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃給藥;糖脈通小劑量組在格列齊特20 mg/kg的基礎上,以生藥濃度為2 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃給藥;糖脈通大劑量組在格列齊特20 mg/kg的基礎上,以生藥濃度為4 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃給藥;西藥對照組在格列齊特20 mg/kg的基礎上,以濃度為1.8 mg/mL的西洛他唑混懸液10 mL/kg灌胃給藥;空白對照組以等容積蒸餾水灌胃。除空白對照組外均給予高糖高脂飼料。藥物干預12周后,采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測各組大鼠血管組織Obestatin mRNA的表達。結果模型對照組、西藥對照組及糖脈通小劑量組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達水平較空白對照組明顯升高(P<0.05);糖脈通大、小劑量組及西藥對照組血管組織中Obestatin mRNA表達較模型對照組減少(P<0.05),且糖脈通大、小劑量組效果優(yōu)于西藥對照組(P<0.05)。結論糖脈通可能通過降低Obestatin mRNA在模型大鼠血管組織中的異常表達,對血管功能起到保護作用。

    【關鍵詞】糖脈通;糖尿病血管病變;高脂血癥;疾病模型,動物;胃促生長素;RNA,信使;逆轉錄聚合酶鏈反應

    糖尿病下肢動脈血管病變(lower-extremity arterial disease,LEAD)是指糖尿病患者出現(xiàn)下肢動脈粥樣硬化及微血管病變?yōu)橹饕±砀淖?,以肢端疼痛、間歇性跛行、潰瘍、壞疽為主要臨床表現(xiàn),是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一。肥胖抑制素(Obestatin)是從大鼠胃組織中分離的一種生長素(Ghrelin)相關肽,可以結合孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR39,產生與Ghrelin相反的作用,具有非常廣泛的生物學功能。本研究通過觀察糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達水平的影響,進一步從實驗方面來驗證其療效,并探討其機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠50只,體質量(200±20) g,由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[動物合格證號:SCXR(魯)2009015]。普通動物飼料由山東省實驗動物中心提供,高糖高脂飼料(清潔級)由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供(配方:10.0%豬油,20.0%蔗糖,10.0%蛋黃粉,0.5%膽酸鈉和59.5%常規(guī)飼料)。

    1.1.2 藥物及試劑 糖脈通藥物組成:黃芪30 g,黃精30 g,桑枝15 g,地龍9 g,水蛭15 g,大血藤15 g,土茯苓30 g。實驗時制成糖脈通濃縮煎劑,分別為2、4 g/mL。西洛他唑片(100 mg/片,浙江大冢制藥有限公司,國藥準字H10960014),格列齊特片(80 mg/片,南京瑞爾醫(yī)藥有限公司,國藥準字H20003361)。鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ):美國Sigma公司生產,北京博愛港商貿有限公司提供。超純RNA提取試劑盒,北京康為世紀生物科技有限公司;ReverTra Ace qPCR RT Kit,Transgene PCR Mix,日本TOYOBO公司;DL2000 DNA Marker,日本TAKARA公司;氯仿分析純,異丙醇,無水乙醇,焦碳酸二乙酯(DEPC)水等。

    1.1.3 實驗儀器 普通高速離心機(5415D型,Eppendorf公司);PCR儀(PTC-200 Peltier Thermal Cycler,美國PE公司);Alpha Imager TM 2200 凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech 公司);Bio Rad 電泳儀及電泳槽(北京東方恒偉科技開發(fā)公司);美國強生穩(wěn)豪全自動血糖儀;移液器(Gilson 產品),Axygen無RNA酶槍頭及eppendorf管等。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 造模方法 取健康SD雄性大鼠50只,以普通動物飼料適應性喂養(yǎng)3 d后,改用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周。最后一次喂食后禁食12 h,斷尾取靜脈血測空腹血糖。然后用0.1 mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液(4 ℃,pH值=4.2)配置濃度為2%的STZ溶液,按30 mg/kg左下腹腔單次注射STZ,制造糖尿病(DM)模型。72 h后斷尾取靜脈血測空腹血糖,選空腹血糖≥16.7 mmol/L的動物作為STZ糖尿病大鼠模型,選取40只進入實驗。

    1.2.2 分組及給藥 將40只成模大鼠隨機分成4組,每組10只。①模型對照組:0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌胃;②糖脈通小劑量組:在用格列齊特20 mg/kg的基礎上,給予生藥濃度為2 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃;③糖脈通大劑量組:在用格列齊特20 mg/kg的基礎上,給予生藥濃度為4 g/mL糖脈通水煎劑10 mL/kg灌胃;④西藥對照組:在用格列齊特20 mg/kg的基礎上,給予濃度為1.8 mg/mL的西洛他唑混懸液10 mL/kg灌胃。另取10只正常大鼠,普通飼料喂養(yǎng),腹腔注射等量無菌枸櫞酸鈉緩沖液,血糖均在4.7~7.3 mmol/L,選為空白對照組,給予等容積蒸餾水灌胃。室溫18~20 ℃,相對濕度69%,12 h交替照明,大鼠自由飲水,除空白對照組外其余各組大鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng),連續(xù)給藥觀察12周。

    1.2.3 組織標本的采集 給藥觀察12周后,斷尾取靜脈血檢測各組動物空腹血糖(取血前禁食8 h)。然后用戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉,開腹于脊柱旁剖離腹主動脈并截取,用0.9%氯化鈉注射液沖洗后,放入-80 ℃冰箱備用。

    1.2.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測轉化生長因子-β1(TGF-β1)。

    1.2.4.1 總RNA提取 按超純RNA提取試劑盒(CW0581)說明書進行。100 mg組織標本經液氮研磨,加入1 mL Buffer RLT,室溫放置5 min,讓組織完全裂解。加200 μL氯仿,充分劇烈震蕩 15 s,室溫放置2~3 min,12 000 r/min離心15 min。將上清液轉移到新的Eppendorf管內,加等量的無水乙醇,混勻,將混合物加到離心柱上,12 000 r/min離心30 s,加異丙醇 1 700 μL,分別12 000 r/min離心30 s,加異丙醇2 500 μL 2次,12 000 r/min離心30 s,14 000 r/min離心2 min,加預熱的DEPC水50 μL,室溫放置2~3 min,12 000 r/min離心30 s,收集RNA。

    1.2.4.2 RT-PCR 反應檢測Obestatin mRNA表達

    逆轉錄:5×BT buffer 2 μL

    Primer Mix 0.5 μL

    Enzyme Mix 0.5 μL

    RNA 1 μg

    DEPC-H2O 補足10 μL

    逆轉錄程序:37 ℃ 15 min,98 ℃ 5 min,

    PCR: 2×PCR mix 10 μL

    10 μmol/L Obestatin上游引物 0.4 μL

    10 μmol/L Obestatin下游引物 0.4 μL

    10 μmol/L β-actin上游引物 0.2 μL

    10 μmol/L β-actin下游引物 0.2 μL

    RT產物 4 μL

    DEPC H2O 補足20 μL

    PCR程序:94 ℃3 min,94 ℃30 s,60 ℃30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán),72 ℃5 min。

    大鼠β-actin上游引物:5’-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3’,

    大鼠β-actin下游引物:5’-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CTT G-3,

    擴增產物:481 bp

    大鼠-Obestatin上游引物:5’-ATG GTG TCT TCA GCG ACT ATC T-3’

    大鼠-Obestatin下游引物:5’-CTC TGC TGG GCT TTC TGG-3’

    擴增產物:113 bp

    1.2.4.3 電泳及數(shù)據分析 1%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠(EB)染料。Alpha imager觀察電泳條帶存入圖象,β-actin的產物為481 bp,Obestatin的產物為113 bp。以系統(tǒng)的SPOT DENSITY 軟件分別測量內參照和Obestatin基因擴增條帶的密度,以Obestatin條帶的密度與內參照管家基因β-actin的密度比值代表基因表達的相對水平。

    2 結 果

    糖脈通對模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達的影響見表1。

    表1 糖脈通對模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達的影響 ±s

    與空白對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,△P<0.05 ;與西藥對照組比較,#P<0.05

    由表1可見,模型對照組、西藥對照組及糖脈通小劑量組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達水平較空白對照組明顯升高(P<0.05);糖脈通大、小劑量組及西藥對照組大鼠血管組織中Obestatin mRNA表達較模型對照組減少(P<0.05),且糖脈通大、小劑量組效果優(yōu)于西藥對照組(P<0.05)。(見封3,圖1)。

    3 討 論

    LEAD屬于糖尿病動脈硬化性疾病,又稱周圍血管病變,是糖尿病最常見的慢性血管并發(fā)癥之一。血管內皮細胞是血管的基本結構,參與血管內外物質交換和血管新生等,具有重要生理作用。血管內皮細胞損傷常常是動脈粥樣硬化(AS)、糖尿病血管并發(fā)癥和高血壓等疾病的始動環(huán)節(jié),并貫穿疾病發(fā)展的整個過程[1]。因此,對血管內皮細胞的保護已成為治療糖尿病大血管病變研究的重要方向。

    某些生長因子對血管內皮細胞的正常代謝及維持血管的基本結構起著重要的作用。Ghrelin是生長激素促分泌激素受體的內源性配體,它是由28個氨基酸殘基構成的小分子短肽[2],傳統(tǒng)認為其對食欲及糖、脂的合成代謝有重要的作用。近來有研究表明,Ghrelin還可降低血管的炎癥反應,通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的細胞核因子(NF)-κB的激活來抑制促炎癥的趨化因子白細胞介素-8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達,從而抑制早期AS的發(fā)生[3]。Obestatin是2005年從大鼠胃組織中分離的一種Ghrelin相關肽,它可以結合孤兒G蛋白偶聯(lián)受體GPR39,產生與Ghrelin相反的作用[4]。Obestatin亦具有非常廣泛的生物學功能,除負向調節(jié)攝食和胃腸運動外[4],也可作用于胰腺胰島組織抑制胰島素、胰多肽、生長抑素等的分泌[5]。另有研究表明Obestatin與各種糖、脂代謝因素密切相關[6]。鑒于對心血管尤其是血管內皮細胞的保護作用,Ghrelin與Obestatin已逐漸成為糖尿病大血管病變的研究熱點。

    本實驗通過觀察糖脈通對糖尿病模型大鼠血管組織Obestatin mRNA表達的影響。結果顯示模型大鼠血管內皮細胞中Obestatin mRNA的表達明顯升高,而糖脈通可顯著抑制Obestatin mRNA在血管內皮的異常表達,效果優(yōu)于西藥對照組。提示糖脈通可能通過抑制Obestatin mRNA在血管內皮的異常表達起到保護血管內皮、延緩血管病變病程的作用。

    [1] Cohen G,Riahi Y,Alpert E,et al.The roles of hyperglycaemia and oxidative stress in the rise and collapse of the natural protective mechanism against vascular endothelial cell dysfunction in diabetes[J].Arch Physiol Biochem,2007,113(4-5):259-267.

    [2] Kojima M,Kangawa K.Ghrelin,an orexigenic signaling molecule from the gastrointestinal tract[J].Curr Opin Pharmacol,2002,2(6):665-668.

    [3] Li WG,Gavrila D,Liu X,et al.Ghrelin inhibits proinflammatory responses and nuclear factor-κB activation in human endothelial cells[J].Circulation,2004,109(18):2221-2226.

    [4] Zhang JV,Ren PG,Avsian-Kretchrner O,et al.Obestatin,a peptide encoded by the ghrelin gene,opposes ghrelin’s effects on food intake[J].Science,2005,310(5750):996-999.

    [5] Ataka K,Inui A,Asakawa A,et al.Obestatin inhibits motor activity in the antrum and duodenum in the fed state of conscious rats[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2008,294(5):G1210-G1218.

    [6] 徐海蓉,鄭興,郭志福.單純性肥胖癥患者外周血ghrelin、obestatin的水平變化及其臨床意義[J].心臟雜志,2009,(1):95-98.

    EffectofTangmaitongonmRNAexpressionofObestatinininthevasculartissueofdiabeticratsmodel

    CAIXinrui*,QIANWeibin,QIANQiuhai,etal.

    *2012Doctor-postgraduate,TheFirstClinicalMedicalCollegeofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicineShandong,Jinan250014

    【Abstract】ObjectiveTo observe the effect and mechanisms of Tangmaitong on mRNA expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model.Method Rat diabetic model were made with STZ and high-quality and high-carbohydrate diet.40 diabetic model rats were randomly divided into four groups,model group,western medicine group,high-and low-dose Tangmaitong group.10 normal rats were as control group.Model group received 0.9% NaCl solution,high-and low-dose Tangmaitong groups received 10mL/kg(2 g/mL,4 g/mL crude drug) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Rat in western medicine group received 10 mL/kg(Cilostazol suspension 1.8 mg/mL) on the basis of Gliclazide,20mg.kg.Control group received equal volume of distilled water.After 12 weeks of drug intervention,rats were killed,the vascular were removed and the mRNA expression of Obestatin in the vascular was observed by the method of RT-PCR.ResultsThe mRNA expression of Obestatin was significantly increased,and Tangmai-tong could lower the mRNA expression of Obestatin in the vascular in a dose-dependent manner.The decrease of the mRNA expression of Obestatin in high-and low-dose Tangmaitong group was superior to that in western medicine group(P<0.05).ConclusionTangmaitong can play a protective effect on vascular function by reducing the abnormal expression of Obestatin in the vascular tissue of diabetic rat’s model,and deserves further research.

    【Key words】Tangmaitong; Diabetic angiopathies; Hyperlipemia; Disease model; Animal; Ghrelin; RNA; Messenger; RT-PCR

    【中圖分類號】R587.230.531;R589.210.531;R342.22

    A

    1002-2619(2013)12-1868-03

    ※ 項目來源:山東省科學技術發(fā)展計劃項目(編號:2010GSF10242);山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(編號:2009Z004)

    山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內分泌科,山東 濟南 250011

    1 日本鳥取大學醫(yī)學部,日本 鳥取 683-8503

    2 山東省禹城市人民醫(yī)院內分泌科,山東 禹城 251200

    3 中國人民解放軍第一○七醫(yī)院內分泌科,山東 煙臺 264000

    蔡欣蕊(1985—),女,博士研究生在讀,碩士。研究方向:中醫(yī)內科學專業(yè)。

    2013-06-17)

    猜你喜歡
    灌胃小劑量空白對照
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實驗教學中的應用
    小劑量激素治療在更年期綜合征治療中的應用探究
    甘肅科技(2020年21期)2020-04-13 00:34:14
    小劑量 大作用 肥料增效劑大有可為
    過表達H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內文第 96 ~ 101 頁)圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    小鼠、大鼠灌胃注意事項
    來曲唑灌胃后EM大鼠病灶體積及COX-2 mRNA、survivin蛋白表達變化
    8 種外源激素對當歸抽薹及產量的影響
    實驗小鼠的灌胃給藥技巧
    小劑量輻射比格犬模型的初步研究
    日韩欧美在线二视频| 中文在线观看免费www的网站 | 一级毛片女人18水好多| 日日夜夜操网爽| 国产成人精品久久二区二区免费| 色综合婷婷激情| 成年版毛片免费区| 久久国产精品影院| 999久久久国产精品视频| av中文乱码字幕在线| 欧美在线黄色| 亚洲av成人av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成在线人永久免费视频| 丝袜美腿诱惑在线| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 后天国语完整版免费观看| 很黄的视频免费| 国产成人啪精品午夜网站| 观看免费一级毛片| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 999精品在线视频| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 久久伊人香网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产又爽黄色视频| 久久精品国产清高在天天线| 国产一卡二卡三卡精品| 淫秽高清视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产av又大| 人人妻人人澡人人看| 午夜福利成人在线免费观看| 男女那种视频在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 男女床上黄色一级片免费看| 欧美日韩乱码在线| 国产成人影院久久av| 一进一出抽搐动态| 91麻豆av在线| 午夜免费鲁丝| 天天一区二区日本电影三级| 欧美三级亚洲精品| 午夜免费成人在线视频| 婷婷六月久久综合丁香| 国产av不卡久久| 夜夜爽天天搞| 两性夫妻黄色片| 亚洲免费av在线视频| 两个人看的免费小视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 男女那种视频在线观看| 欧美性长视频在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲第一av免费看| 天堂√8在线中文| 欧美日韩乱码在线| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲avbb在线观看| 人人澡人人妻人| 色婷婷久久久亚洲欧美| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产成人系列免费观看| av有码第一页| 久久亚洲真实| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 色在线成人网| 亚洲精品美女久久av网站| 日本a在线网址| 在线观看日韩欧美| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产av在哪里看| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 人成视频在线观看免费观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品 欧美亚洲| 国产熟女xx| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中亚洲国语对白在线视频| 精品无人区乱码1区二区| 国产人伦9x9x在线观看| 一本综合久久免费| 国产成人欧美| 久久亚洲精品不卡| 天天添夜夜摸| 制服诱惑二区| 国产久久久一区二区三区| 丁香六月欧美| 女同久久另类99精品国产91| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 天堂√8在线中文| 亚洲av熟女| 一进一出抽搐动态| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 999精品在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| av在线天堂中文字幕| 在线观看日韩欧美| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲真实伦在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 最近在线观看免费完整版| 欧美中文综合在线视频| 一本综合久久免费| 国产爱豆传媒在线观看 | 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产精品久久视频播放| 婷婷丁香在线五月| 99久久99久久久精品蜜桃| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久中文字幕一级| 午夜精品久久久久久毛片777| 天堂影院成人在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 一区福利在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 国产真实乱freesex| 天堂影院成人在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品二区激情视频| 欧美在线一区亚洲| 成人国语在线视频| 丁香六月欧美| 久久婷婷成人综合色麻豆| 在线永久观看黄色视频| 性色av乱码一区二区三区2| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品一区二区免费欧美| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 亚洲中文字幕日韩| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 免费高清视频大片| 久久精品成人免费网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美成人午夜精品| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品二区激情视频| www.www免费av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成年版毛片免费区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 俄罗斯特黄特色一大片| 人人妻人人澡人人看| 可以在线观看毛片的网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 一进一出好大好爽视频| 麻豆av在线久日| 久久久久国产一级毛片高清牌| 成人永久免费在线观看视频| 午夜免费成人在线视频| 女性生殖器流出的白浆| 大香蕉久久成人网| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品人妻1区二区| 波多野结衣高清作品| 精品欧美国产一区二区三| 人人澡人人妻人| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品久久久久久精品电影 | 女性被躁到高潮视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 成人永久免费在线观看视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 很黄的视频免费| 婷婷丁香在线五月| netflix在线观看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 男人舔女人的私密视频| 亚洲中文av在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美黑人巨大hd| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩国内少妇激情av| 搡老岳熟女国产| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美黄色淫秽网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产成人系列免费观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线视频色国产色| 日本免费a在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲美女黄片视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 此物有八面人人有两片| 久久久久久大精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| av电影中文网址| 色在线成人网| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产精品国产高清国产av| 美女午夜性视频免费| 大型av网站在线播放| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产精品免费视频内射| 国产精品久久久久久精品电影 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久国产成人免费| 人人妻人人看人人澡| av天堂在线播放| 久久久精品欧美日韩精品| 成年女人毛片免费观看观看9| 手机成人av网站| 欧美午夜高清在线| 青草久久国产| 黄色毛片三级朝国网站| 国产成人欧美| 久久久国产精品麻豆| 国产视频内射| 女性被躁到高潮视频| 国产免费av片在线观看野外av| 午夜免费激情av| 免费观看精品视频网站| 97碰自拍视频| 欧美日韩乱码在线| 国产精品久久电影中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日韩三级视频一区二区三区| 午夜老司机福利片| 国产成+人综合+亚洲专区| avwww免费| 中国美女看黄片| 怎么达到女性高潮| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美激情高清一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 女同久久另类99精品国产91| 老汉色av国产亚洲站长工具| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 一夜夜www| 色尼玛亚洲综合影院| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 啦啦啦 在线观看视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 在线观看舔阴道视频| av在线播放免费不卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品在线美女| 成人免费观看视频高清| 在线av久久热| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲五月天丁香| 免费观看精品视频网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品国产乱码久久久久久男人| 美女扒开内裤让男人捅视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品亚洲美女久久久| 国产高清激情床上av| 国产精华一区二区三区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 一区福利在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 18美女黄网站色大片免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产av在哪里看| 一级片免费观看大全| 正在播放国产对白刺激| 亚洲精品国产区一区二| 91成年电影在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 长腿黑丝高跟| 两人在一起打扑克的视频| 不卡av一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 免费在线观看黄色视频的| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 午夜福利一区二区在线看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 好男人电影高清在线观看| а√天堂www在线а√下载| 正在播放国产对白刺激| 嫩草影视91久久| 色播亚洲综合网| 成人一区二区视频在线观看| 美女午夜性视频免费| 午夜精品在线福利| 亚洲av片天天在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产成人影院久久av| 精品久久久久久久久久免费视频| www.熟女人妻精品国产| 老汉色∧v一级毛片| 听说在线观看完整版免费高清| www.熟女人妻精品国产| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成人午夜高清在线视频 | 国产黄a三级三级三级人| 欧美国产精品va在线观看不卡| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美成狂野欧美在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 成人免费观看视频高清| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲第一av免费看| 精品不卡国产一区二区三区| 国产私拍福利视频在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 婷婷丁香在线五月| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品九九99| 欧美中文综合在线视频| 老司机靠b影院| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品永久免费网站| 精品电影一区二区在线| 久久精品成人免费网站| 亚洲av成人一区二区三| 他把我摸到了高潮在线观看| xxxwww97欧美| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| a级毛片a级免费在线| www.精华液| 日日夜夜操网爽| 国产av在哪里看| 午夜福利在线观看吧| 丁香六月欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲中文字幕日韩| 男女之事视频高清在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美av亚洲av综合av国产av| 俺也久久电影网| 韩国av一区二区三区四区| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美一级毛片孕妇| 精品电影一区二区在线| 麻豆av在线久日| 亚洲一区二区三区不卡视频| 十八禁网站免费在线| √禁漫天堂资源中文www| 国产1区2区3区精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 禁无遮挡网站| 国产乱人伦免费视频| 亚洲九九香蕉| 国产精品二区激情视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 12—13女人毛片做爰片一| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 香蕉丝袜av| 中文字幕久久专区| 国产又爽黄色视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美激情高清一区二区三区| 看免费av毛片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 无人区码免费观看不卡| 国产亚洲av高清不卡| 91av网站免费观看| 午夜免费鲁丝| 久久亚洲精品不卡| 99热6这里只有精品| 精品国产亚洲在线| 淫秽高清视频在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久九九热精品免费| 一本大道久久a久久精品| avwww免费| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美不卡视频在线免费观看 | 午夜a级毛片| 99久久国产精品久久久| 免费在线观看日本一区| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲成人久久性| 久久久久国内视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲精品在线观看二区| tocl精华| 国产亚洲精品av在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 少妇的丰满在线观看| 成人国产综合亚洲| 国产av不卡久久| 在线播放国产精品三级| 国产男靠女视频免费网站| www.www免费av| 一本综合久久免费| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美午夜高清在线| 国产久久久一区二区三区| 欧美av亚洲av综合av国产av| av视频在线观看入口| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产视频一区二区在线看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产精品影院久久| 久久久国产成人免费| 动漫黄色视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 在线国产一区二区在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 首页视频小说图片口味搜索| 免费观看精品视频网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜免费鲁丝| 国产国语露脸激情在线看| 精品久久久久久久久久久久久 | 极品教师在线免费播放| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品色激情综合| 欧美大码av| 日韩欧美一区视频在线观看| www国产在线视频色| 日本五十路高清| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人av一区二区三区在线看| 青草久久国产| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 1024视频免费在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品免费久久久久久久清纯| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品九九99| 一级毛片精品| 亚洲精品美女久久av网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产私拍福利视频在线观看| 伦理电影免费视频| 免费av毛片视频| 日本在线视频免费播放| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 婷婷六月久久综合丁香| 精品免费久久久久久久清纯| 一本综合久久免费| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲第一电影网av| 国产亚洲精品一区二区www| 91av网站免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 国产亚洲精品av在线| 久久中文看片网| 最近最新中文字幕大全电影3 | 丝袜美腿诱惑在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲成人国产一区在线观看| 一本精品99久久精品77| 欧美日本亚洲视频在线播放| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲无线在线观看| 精品国产国语对白av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久人妻av系列| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 99久久精品国产亚洲精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| av福利片在线| 国产成人欧美| 久9热在线精品视频| 国产人伦9x9x在线观看| 免费在线观看完整版高清| 人人澡人人妻人| 国产av不卡久久| 窝窝影院91人妻| 国产一区在线观看成人免费| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲国产精品999在线| 久久久久久久精品吃奶| 黄色成人免费大全| cao死你这个sao货| 天天一区二区日本电影三级| 国产99白浆流出| 久9热在线精品视频| 男人舔女人的私密视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久久久人人人人人| 91av网站免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品91无色码中文字幕| 久久热在线av| 欧美黑人欧美精品刺激| 日日爽夜夜爽网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品高清国产在线一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 窝窝影院91人妻| 黄色视频,在线免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 嫩草影院精品99| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲第一电影网av| 一二三四社区在线视频社区8| 久久热在线av| 欧美性猛交黑人性爽| 国产真实乱freesex| 日韩精品青青久久久久久| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美黑人精品巨大| 日本一本二区三区精品| 亚洲熟妇熟女久久| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩欧美免费精品| 亚洲av五月六月丁香网| av欧美777| 欧美久久黑人一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 视频区欧美日本亚洲| 欧美色视频一区免费| 精品人妻1区二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美又色又爽又黄视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 男人舔女人的私密视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黄色女人牲交| 一级毛片女人18水好多| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产片内射在线| 国产黄a三级三级三级人| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费在线观看完整版高清| 一区二区三区国产精品乱码| 国产亚洲欧美在线一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 两个人视频免费观看高清| 欧美性长视频在线观看| 十八禁人妻一区二区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 中国美女看黄片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜老司机福利片| av欧美777| √禁漫天堂资源中文www| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 长腿黑丝高跟| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品国产乱码久久久久久男人| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜精品在线福利| 无遮挡黄片免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 香蕉av资源在线| 99国产精品99久久久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久亚洲真实| 老汉色∧v一级毛片| www国产在线视频色| 18禁国产床啪视频网站| 99国产精品99久久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久久九九精品二区国产 | 一级毛片女人18水好多|