缺氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長因子在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系

廉紅星 李玉強(qiáng) 趙 敏 劉瑞吉

(河北省秦皇島市第一醫(yī)院骨三科，河北 秦皇島 066000)

骨肉瘤也稱成骨肉瘤，是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，常發(fā)生于青少年，惡性程度高，約30%的患者對化療藥物不敏感，預(yù)后差[1]。2000-01—2005-12，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP)法，觀察了缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)35例在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算微血管密度(MVD)，探討HIF-1α和VEGF在骨肉瘤血管形成中所起的作用，并選取14例骨軟骨瘤患者對照觀察，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 骨肉瘤、骨軟骨瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照《軟組織與骨腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》[2]。

1.2 一般資料 35例骨肉瘤和14例骨軟骨瘤均為我院病理科存檔標(biāo)本蠟塊。骨肉瘤中男22例，女13例；年齡11～55歲，平均(21.1±0.5)歲；骨肉瘤臨床分期[2]：Ⅱa 5例，Ⅱb 18例，Ⅲ期12 例。骨軟骨瘤中男10例，女4例；年齡10～34歲，平均(19.5±0.4)歲。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 4 μm厚度石蠟切片，60 ℃烤片3 h，SP法染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)，酒精梯度脫水，二甲苯透明，封固切片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗作陰性對照，用已知的陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 ①HIF-1α、VEGF SP染色陽性反應(yīng)為棕黃色和(或)棕褐色顆粒，HIF-1α主要定位于細(xì)胞核，VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。每張切片選取10個(gè)高倍視野(×400)觀察陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，無陽性細(xì)胞者為陰性(-)，<50%細(xì)胞著黃色或<30%細(xì)胞著棕黃色者為陽性(+)，>50%細(xì)胞著黃色或>30%細(xì)胞著棕黃色者為強(qiáng)陽性(++)。染色陽性及強(qiáng)陽性合并為染色陽性組，與染色陰性組比較。②CD34特異性標(biāo)記腫瘤組織的新生血管，MVD根據(jù)CD34表達(dá)量參照Bevilacqua P等[3]報(bào)道的方法計(jì)算。染色陽性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，陽性著色為與背景明顯有別的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇團(tuán)，呈棕黃色，只要與鄰近血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開，均看作1個(gè)微血管，染色模糊、肌層較厚或管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管不計(jì)數(shù)。先在低倍鏡(×100)下選取骨肉瘤組織陽性染色血管高密度區(qū)，選擇3個(gè)著色最密集的區(qū)域(新生血管熱點(diǎn)區(qū))，然后在高倍鏡(×400)下計(jì)數(shù)視野范圍內(nèi)陽性染色的微血管。每例標(biāo)本取3個(gè)視野，取其平均值作為每例標(biāo)本的MVD。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤組織中的表達(dá) 見表1。

由表1可見，HIF-1α蛋白染色主要表達(dá)于細(xì)胞核，在骨肉瘤中陽性表達(dá)率高于在骨軟骨瘤中陽性表達(dá)率(P<0.05)。VEGF蛋白染色主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，在骨肉瘤中陽性表達(dá)率高于在骨軟骨瘤中陽性表達(dá)率(P<0.05)。

表1 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤組織中的表達(dá)例(%)

與骨軟骨瘤比較，*P<0.05

2.2 HIF-1α、VEGF表達(dá)與骨肉瘤Enneking分期的關(guān)系 見表2。

表2 HIF-1α、VEGF表達(dá)與骨肉瘤Enneking分期的關(guān)系 例(%)

與Ⅲ期比較，*P<0.05

由表2可見，Ⅲ期骨肉瘤的HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與Ⅱa期、Ⅱb期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Ⅱa期與Ⅱb期的表達(dá)強(qiáng)度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性 見表3。

表3 HIF-1α、VEGF在骨肉瘤中表達(dá)的相關(guān)性 例(%)

由表3可見，35例骨肉瘤標(biāo)本中有14例(40.0%) HIF-1α和VEGF的表達(dá)同時(shí)呈陽性，13例(37.1%)HIF-1α和VEGF的表達(dá)同時(shí)呈陰性，8例(22.9%) HIF-1α和VEGF的表達(dá)呈不一致性。HIF-1α和VEGF在骨肉瘤中的表達(dá)呈正相關(guān)。

2.4 HIF-1α、VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系 見表4。

表4 HIF-1α、VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系

表4 HIF-1α、VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系

nMVD HIF-1α(+)1528.12±7.84*(-)2012.12±3.86VEGF(+)2132.36±7.52△(-)1414.10±3.43

與HIF-1α(-)比較，*P<0.01；與VEGF(-)比較，△P<0.01

由表4可見，HIF-1α(+)、VEGF(+)的MVD值均顯著高于HIF-1α(-)、VEGF(-)(P<0.01)。

3 討 論

實(shí)體瘤生長迅速，局部血管無法提供充足血運(yùn)，以及微循環(huán)破壞、貧血等原因?qū)е聦?shí)體瘤組織中氧濃度普遍低于2%[4]。骨肉瘤組織細(xì)胞中存在的低氧環(huán)境不僅抑制腫瘤細(xì)胞生長，而且調(diào)控腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)而存活[5]。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是作為被低氧誘導(dǎo)的、連接在促紅細(xì)胞生成素基因低氧反應(yīng)元件上的一個(gè)核因子被發(fā)現(xiàn)[6]。缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體細(xì)胞中，主要由HIF-1α和HIF-1β 2個(gè)亞單位組成，其中HIF-1α主要依賴于細(xì)胞間的氧供，決定了HIF-1α的活性。缺氧是實(shí)質(zhì)性腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，缺氧狀態(tài)可誘導(dǎo)一系列特異性的與血管新生、缺氧代謝密切相關(guān)的基因表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，在此過程中起關(guān)鍵作用的是HIF-1α[7]。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中HIF-1α蛋白陽性表達(dá)率為34.3%(12/35)，與骨軟骨瘤比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HIF-1α在骨肉瘤中存在過表達(dá)現(xiàn)象，同時(shí)對MVD的測定顯示HIF-1α與骨肉瘤中血管生成明顯相關(guān)，與骨肉瘤的分期也密切相關(guān)，以上均提示HIF-1α在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展以及血管生成中可能起到重要作用。

VEGF是刺激腫瘤血管生成最關(guān)鍵的因子，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，能特異結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的受體，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和新生血管的形成，并增加血管通透性，增加毛細(xì)血管后靜脈和小靜脈的通透性，引起細(xì)胞外基質(zhì)改變從而促進(jìn)新基質(zhì)形成，為腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[8]。VEGF是HIF-1調(diào)控的最重要靶基因之一，參與腫瘤血管生成，為目前評價(jià)骨肉瘤血管生成最客觀的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，VEGF在骨肉瘤中也存在過表達(dá)現(xiàn)象，陽性表達(dá)率為82.9%(29/35)，顯著高于在骨軟骨瘤中陽性表達(dá)率(P<0.05)。

本研究結(jié)果還顯示，HIF-1α和VEGF在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中所起作用具有某種程度的關(guān)聯(lián)性，HIF-1α和VEGF均為陽性的骨肉瘤中MVD明顯高于兩者均為陰性時(shí)，提示兩者可能在促進(jìn)腫瘤血管生成中也存在協(xié)同效應(yīng)，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究，以期為抗腫瘤治療提供新的對策。

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