HPLC法測(cè)定紫花地丁配方顆粒中秦皮乙素的含量*

★ 胥愛麗 江潔儀 羅文匯 李養(yǎng)學(xué) 李素梅 譚志燦 (廣東省中醫(yī)研究所 廣州510095)

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草，具有清熱解毒，涼血消腫之功效，用于治療疔瘡腫毒，癰疽發(fā)背，丹毒，毒蛇咬傷等癥［1］。紫花地丁含有多種化學(xué)成分，如:黃酮及其苷類、香豆素及其苷類、植物甾醇、生物堿、揮發(fā)油、糖類等。其中黃酮類化合物及香豆素類化合物是紫花地丁中重要的活性成分［2］。紫花地丁配方顆粒是由紫花地丁飲片經(jīng)提取后濃縮干燥而成，其中秦皮乙素在紫花地丁配方顆粒有效部位化學(xué)成分中的含量較高，且具有明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用［3］。中國藥典2010年版一部并未收載紫花地丁的含量測(cè)定方法，且目前文獻(xiàn)的報(bào)道主要針對(duì)紫花地丁藥材及復(fù)方中藥制劑中秦皮乙素的含量測(cè)定［4－11］，而對(duì)中藥新型飲片紫花地丁配方顆粒中秦皮乙素的含量測(cè)定方法卻未見報(bào)道。本研究建立了紫花地丁配方顆粒的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，為紫花地丁配方顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，PDA檢測(cè)器，四元梯度泵，Empower Pro色譜工作站，METTLER TOLEDO型電子分析天平，KQ5200DE型超聲波清洗器。

1．2 試藥 甲醇為色譜純?cè)噭?一級(jí))，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純;秦皮乙素對(duì)照品(批號(hào):741－9002)購于中國藥品生物制品檢定所;紫花地丁配方顆粒(批號(hào):1104308)購于廣東一方制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱:Waters XBridgeTM C18(4．6mm ×250mm，5μm)柱;流動(dòng)相:甲醇(A)－0．4%磷酸溶液(B)，梯度洗脫;洗脫梯度:0－15分鐘，20% －25%A，15－30 分鐘，25% －40%A，30－35分鐘，40% －60%A，35－60分鐘，60% －95%A;檢測(cè)波長:236nm;柱溫:25℃;流速:0．8mL/分;進(jìn)樣量10μL。

2．2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取秦皮乙素對(duì)照品4．47 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2．3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0．2g，精密稱定，置50mL具塞錐瓶中，精密加入甲醇50mL，稱重，超聲處理(功率200W，頻率40kHz)30分鐘，取出，放冷，加甲醇補(bǔ)充減失重量，搖勻，過0．45μm濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2．4 線性范圍的考察 分別精密吸取秦皮乙素對(duì)照品溶液(每 1mL含秦皮乙素 11．06μg)2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，秦皮乙素對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=3000X+3540，r=0．999 971。表明秦皮乙素在178．8－1072．8ng范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2．5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液(0．0894mg·mL－1)10μL重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值的RSD為1．59%，表明儀器精密度良好。

2．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品供試液(批號(hào)1104308)分別于0、2、4、8、12、24 小時(shí)進(jìn)樣 10μL，測(cè)得樣品中秦皮乙素峰面積值的RSD為1．84%，表明樣品供試液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2．7 重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的含量測(cè)定方法，取同一批樣品(批號(hào):1104308)6份，分別制備供試液，測(cè)得峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果供試品中秦皮乙素的RSD為 1．55%。

2．8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)1104308)，分別精密加入一定量的秦皮乙素對(duì)照品，按供試品制備與測(cè)定方法，平行做9組，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 秦皮乙素回收率測(cè)定結(jié)果

2．9 樣品的測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品中苦參堿含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上對(duì)秦皮配方顆粒中秦皮乙素的含量測(cè)定方法進(jìn)行摸索。實(shí)驗(yàn)表明，秦皮乙素在秦皮配方顆粒中含量較高，且具有明顯的藥理作用，故選擇其作為指標(biāo)成分對(duì)秦皮配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制。

圖1 紫花地丁配方顆粒HPLC色譜圖

對(duì)秦皮乙素對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長掃描(190－400nm)，在236nm處有最大吸收，故選擇236nm作為檢測(cè)波長。曾采用甲醇－0．4%磷酸溶液(20∶80)等度洗脫作為流動(dòng)相，但雜峰較多，雜峰在等度洗脫的條件下出峰時(shí)間較晚，導(dǎo)致樣品分析時(shí)間較長，故采用甲醇－0．4%磷酸溶液梯度洗脫的方法進(jìn)行測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)秦皮配方顆粒中所含秦皮乙素的含量進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為秦皮配方顆粒的質(zhì)量控制方法。

［1］國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典［S］．一部，北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:317．

［2］毛曉霞，苗光新，于海龍，等．紫花地丁的研究進(jìn)展［J］．承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27(3):302．

［3］陳胡蘭，湯沛然，張梅，等．不同產(chǎn)地紫花地丁中秦皮乙素的含量比較［J］．成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(1):68．

［4］王冬萍，周建華，將慧．HPLC法測(cè)定二丁片中秦皮乙素的含量［J］．中國保健營養(yǎng)，2012，06:1 566．

［5］趙慶華，楊雪萍，王寶全，等．消炎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］．中國藥事，2011，25(1):65．

［6］常亮，陳珍珍．HPLC法測(cè)定紫花地丁軟膏中秦皮乙素的含量［J］．江西中醫(yī)藥，2011，4(42):68．

［7］林夏楠，林巧之．紫花地丁中秦皮乙素含量測(cè)定研究［J］．海峽藥學(xué)，2008，20(9):60．

［8］林莉，麥曦，仲英，等．紫花地丁高效液相色譜法指紋圖譜的建立和評(píng)價(jià)［J］．理化檢驗(yàn) －化學(xué)分冊(cè)，2011，47(12):1 461．

［9］袁志軍．紫花地丁軟膏的制備與含量測(cè)定［J］．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(6):14．

［10］郭曉秋．HPLC法測(cè)定紫花地丁中秦皮乙素的含量［J］．江西中醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，18(1):34．