超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水中12種抗生素

張曉燕，李志強，李領川，劉艷麗

(1.洛陽市環(huán)保設計研究所，洛陽471000;2.洛陽市澗西污水處理廠，洛陽471000;3.中州大學實驗管理中心，鄭州450044)

抗生素(antibiotics)是生物(包括微生物、植物和動物)在其生命活動過程中所產(chǎn)生的、或由其他方法獲得的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物功能的有機物質(zhì)。［1-2］20世紀70年代以來，抗生素的廣泛而大量應用及濫用所導致的細菌耐藥性已成為威脅人類的焦點問題［3］。我國是抗生素的生產(chǎn)和使用大國，抗生素濫用現(xiàn)象尤為嚴重，醫(yī)用、畜用、水產(chǎn)養(yǎng)殖及醫(yī)藥工業(yè)廢水中的抗生素不能得到有效處理使水資源安全利用的巨大挑戰(zhàn)。目前，水環(huán)境中抗生素的色譜檢測技術有高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)技術［4］、高效液相色譜-紫外吸收(HPLC-UV)檢測技術［5］和高效液相色譜-熒光(HPLC-FD)檢測技術［6］。本文采用超高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLCMS/MS)測定水體中12種抗生素，取得了良好的效果。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)，配TQD三重四極桿質(zhì)譜檢測器(美國Waters公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);.022umPTFE針式過濾器(上海安普科學儀器有限公司);AS3120B型數(shù)控超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

甲醇、甲酸均為色譜純，購自美國TEDIA;其余試劑為分析純;實驗室用水為Milli-Q制備的超純水;實際水樣采自某地下井水，某污水處理廠進、出口，某醫(yī)院廢水排出口。

1.2 實驗條件

1.2.1 標準溶液的配置

分別準確稱取12種抗生素固體標準品，加入適量甲醇超聲溶解，配置成質(zhì)量濃度為10mg/L的標準溶液，儲備待用。移取適量10 mg/L的標準溶液，用甲醇稀釋成0.1 mg/L的中間液。用10%甲醇稀釋，分別配置質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ug/L 的標準工作溶液。再配置質(zhì)量濃度分別為1.0、10.0 ug/L的質(zhì)量控制溶液。

1.2.2 UPLC 條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 um;美國 Waters公司);柱溫:40 ℃;進樣體積:10 uL;流動相 A:甲醇;流動相 B:水(含0.1%(v/v)甲酸);流速:0.3 mL/min。梯度程序:0～1 min，10%A;1 ～1.5 min，10%A ～45%A;1.5 ～3 min，45%A ～55%A;3～4 min，55%A ～65%A;4～5 min，65%A ～95%A;5 ～6 min，95%A;6.1 ～10 min，95%A ～10%A。

1.2.3 MS/MS 條件

采用電噴霧離子源，正離子多反應檢測(MRM)模式。毛細管電壓為0.5 kv，離子源溫度為120℃，脫熔劑氣(氮氣)溫度為350℃，脫溶劑氣流速為650 L/hr，碰撞氣流速為50 L/hr。12種抗生素的檢測離子、錐孔電壓(cone voltage)和碰撞能量(collision energy)見表1。

表1 12種抗生素的UPLC-MS/MS分析參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS parameters of 12 antibiotics

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

本實驗使用ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm ×2.1 mm，1.7 um;美國 Waters公司)，待測物質(zhì)分離良好且峰形對稱，12種抗生素標準溶液的MRM色譜圖見圖1。

對12種抗生素，采用調(diào)諧的方法確定最佳錐孔電壓和碰撞能量。將10ug/L的12種抗生素類藥物的標準溶液以10 ul/min的流速連續(xù)注射進入ESI離子源中。在正離子檢測模式下對12種藥物進行一級質(zhì)譜分析(MS SCAN)，得到母離子［M+H+］峰，逐步改變錐孔電壓，觀察質(zhì)譜響應信號，分別選擇合適的錐孔電壓;再對母離子峰進行二級質(zhì)譜分析(MSMS SCAN)，調(diào)節(jié)優(yōu)化碰撞能量，得到碎片離子信息;選擇響應值高、極限噪音低的離子對作為監(jiān)測離子對(定性離子對)，最終選擇響應值高，峰形對稱的子離子作為定量離子。由于12種抗生素出峰較為分散，因此采用MRM模式時，數(shù)據(jù)采集采用分段采集模式以便提高靈敏度。通過以上方法確定了1.2.3節(jié)所述的質(zhì)譜條件。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系、檢出限和定量限

在優(yōu)化的實驗條件下，對質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ug/L 的標準工作溶液進行測定，以質(zhì)量濃度為(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行曲線回歸，在0.1～50ug/L范圍內(nèi)，12種抗生素均呈良好的線性關系，結(jié)果見表2。

表2 12種抗生素的線性方程和相關系數(shù)

2.2.2 準確度、精密度實驗

以實驗室純水為基質(zhì)，采用加標回收法進行回收率和精密度試驗，添加2.0、10.0ug/L 2個水平濃度，每個水平重復測定7次，平均回收率為90.9%～113.0%，相對標準偏差(RSD)為 1.86% ～7.87%(見表 3)。

表3 12種抗生素類藥物的加標回收率與精密度

2.3 實際樣品的分析

采用本方法對某地下水，某污水處理廠進口、出口生活污水，某肛腸醫(yī)院廢水實際水樣進行分析，測定效果好，實用性強，完全能滿足環(huán)境水體中12種抗生素檢測要求，測定結(jié)果見表4。

表4 實際水樣中12種抗生素測定結(jié)果(ug/L)

3.結(jié)語

本文所建立的UPLC-MS/MS方法可同時檢測地下水、生活污水、醫(yī)院廢水中12種抗生素藥物的含量，操作簡單、快速，測定結(jié)果準確可靠，適用于水中抗生素類藥物殘留的定性定量分析。

圖1 12種抗生素子離子流圖

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