理性設(shè)計和構(gòu)建過量合成莽草酸的大腸桿菌代謝工程菌

李明明，陳獻(xiàn)忠，周麗，沈微，樊游，王正祥

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院, 江蘇 無錫 214122

莽草酸是芳香族氨基酸和一些手性化合物合成的重要中間體[1]，本身具有眾多的生理功能和藥理作用，如通過影響花生四烯酸代謝來抑制血小板聚集，從而可以抑制動、靜脈血栓及腦血栓形成；具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，是抗病毒和抗癌藥物的中間體[2]。此外，莽草酸是合成有效抗禽流感藥物-達(dá)菲的重要原料[3]。莽草酸途徑廣泛存在于細(xì)菌、子囊真菌、寄生蟲和植物中[4-7]。

傳統(tǒng)的莽草酸生產(chǎn)方式主要有兩種：從八角屬植物的果實(shí)中提取[8]，或通過化學(xué)合成手段獲得。前者由于原材料的生長受地域限制及氣候的影響，嚴(yán)重制約了莽草酸的大規(guī)模生產(chǎn)[9]；后者由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高也不能滿足莽草酸的大量需求。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)莽草酸在生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)工藝等方面具有顯著的優(yōu)勢。因此，通過代謝工程育種獲得高產(chǎn)莽草酸的微生物菌種并發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸具有廣闊的應(yīng)用前景。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、生長速度快、發(fā)酵周期短以及易于分子操作等優(yōu)勢，是代謝工程育種中最常用的宿主。如圖1所示，大腸桿菌中莽草酸途徑是芳香族氨基酸合成的共同途徑，包含7步酶催化反應(yīng)，最終生成分支酸。首先由糖酵解途徑中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)和 HMP途徑的4-磷酸赤蘚糖 (E4P)縮合形成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸 (DAHP)起始，該反應(yīng)由aroF、aroG和aroH基因編碼的DAHP合成酶催化，這3個同工酶分別受到L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的反饋抑制[10]。PEP來自糖酵解途徑，也可由 ppsA基因編碼的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A催化丙酮酸轉(zhuǎn)化得到。tktA基因編碼的轉(zhuǎn)酮酶A是磷酸戊糖途徑中生成E4P的關(guān)鍵酶。DAHP經(jīng)過一系列反應(yīng)后生成代謝中間產(chǎn)物莽草酸，后者在莽草酸激酶的作用下生成莽草酸-3-磷酸 (S3P)，并最終合成 3種芳香族氨基酸。PEP和E4P是莽草酸合成的前體物質(zhì)，它們的合成和積累直接決定著莽草酸的合成能力。大量文獻(xiàn)表明，通過消除競爭途徑，解除限速步驟或增強(qiáng)前體代謝產(chǎn)物的供應(yīng)，從而加強(qiáng)目的代謝產(chǎn)物的積累是微生物代謝工程常用的一種行之有效的方法[11]。

圖1 大腸桿菌莽草酸途徑Fig. 1 Pathway of shikimic acid in E. coli.

基于 Red重組系統(tǒng)的基因刪除技術(shù)是最近幾年來國際上進(jìn)行細(xì)菌代謝工程研究的常用方法之一。Red重組系統(tǒng)的原理是在來源于λ噬菌體的exo、bet、gam三個基因控制的重組酶的作用下，染色體DNA可以與外源線性DNA片段通過兩翼較短的同源序列高頻重組，使其整合到染色體上，并將染色體上的對應(yīng)序列置換下來[12]。本實(shí)驗(yàn)在Red重組系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌自身所含有的Xer重組酶能夠識別dif序列的特點(diǎn)[13]，運(yùn)用dif-dif重組將目的基因的兩端同源臂連接，從而去除了其中的抗性基因標(biāo)記。本研究中的基因刪除原理如圖2所示。

圖2 基因刪除流程Fig. 2 Schemes of gene inactivation approach.

為了有效利用大腸桿菌莽草酸途徑合成莽草酸，在分析大腸桿菌莽草酸代謝網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，首先利用Red-Xer重組系統(tǒng)刪除了莽草酸途徑中莽草酸激酶的編碼基因aroL和aroK，從而阻斷了莽草酸向莽草酸-3-磷酸的代謝反應(yīng)，提高了莽草酸的累積。通過刪除編碼 EIICBglc蛋白的ptsG基因部分阻斷了大腸桿菌依賴于PEP的葡萄糖過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)，使得細(xì)胞的葡萄糖運(yùn)輸主要依賴于半乳糖協(xié)同運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)行[14]。為了減少副產(chǎn)物奎寧酸 (QA)的生成，進(jìn)一步刪除了 ydiB基因。最終獲得的大腸桿菌代謝工程菌的莽草酸合成和累積能力顯著提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

大腸桿菌Escherichia coli CICIM B0013由本中心篩選、保藏；E. coli JM109由本中心保藏；質(zhì)粒pKD46 (溫敏型復(fù)制子，含有阿拉伯糖啟動子調(diào)控的gam、bet和exo基因，Ampr)由本中心保藏；質(zhì)粒 pSK-EcdifGm (含有 dif位點(diǎn)，Ampr，Gmr)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；pMD18-T-simple購自TaKaRa (大連公司)。本實(shí)驗(yàn)所用到的大腸桿菌菌株見表1，本實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

大腸桿菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基和質(zhì)粒增殖培養(yǎng)基LB (/L)：5 g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g NaCl；固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加 1.5%～2%的瓊脂粉。培養(yǎng)基中氨芐青霉素鈉和慶大霉素的終濃度分別為 100 μg/mL 和 30 μg/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (/L)：13 g Na2HPO4·H2O，3 g KH2PO4，0.5 g NaCl，0.1 g NH4Cl，1.2 g MgSO4，0.7 g L-苯丙氨酸，0.35 g L-色氨酸，0.7 g L-酪氨酸，0.3 g檸檬酸鐵銨，2.1 g一水合檸檬酸，0.01 g對羥基苯甲酸，0.01 g對氨基苯甲酸鉀，0.01 g 2,3-二羥基苯甲酸，15 g酵母抽提物，20 g蛋白胨，25 g葡萄糖。

dNTPs、Taq DNA聚合酶購自上海華諾公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒以及DNA片段快速膠回收試劑盒均購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自TaKaRa (大連)公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司；引物合成及測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成；其余試劑均是國產(chǎn)分析純。

表1 本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的重組菌Table 1 Escherichia coli strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 利用Red-Xer重組系統(tǒng)刪除基因

根據(jù)文獻(xiàn)報道方法[13,15]，分別進(jìn)行 aroL、aroK、ptsG和ydiB基因的刪除。

1.2.1 利用Red-Xer重組系統(tǒng)刪除aroL基因

用以 aroL基因上下游設(shè)計的引物 aLup和aLdn擴(kuò)增大腸桿菌染色體DNA上的aroL基因，片段大小為575 bp，PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T-simple載體中，獲得重組質(zhì)粒 pMD-aroL。以該重組質(zhì)粒為模板，用引物L(fēng)verp、Lverdn進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物與difGm片段連接得到重組質(zhì)粒 pMD-aroL′::difGm。以重組質(zhì)粒pMD-aroL′::difGm 為模板，用第一組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到片段aroL′::difGm，即aroL基因的突變盒。

將aroL基因突變盒電擊轉(zhuǎn)入出發(fā)菌B0013/pKD46細(xì)胞后立即加入含有濃度為1 mmol/L的L-阿拉伯糖的液體LB培養(yǎng)基，30 ℃、100 r/min條件下后培養(yǎng)4～6 h，然后涂布于含有慶大霉素的抗性平板，利用引物YL、aLdn進(jìn)行菌落PCR鑒定獲得正確重組的轉(zhuǎn)化子并轉(zhuǎn)接于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)條件下多次轉(zhuǎn)接傳代后，劃線分離出單菌落并挑選出慶大霉素抗性丟失的轉(zhuǎn)化子，并用YL、aLdn引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.2 利用 Red-Xer重組系統(tǒng)刪除 aroK、ptsG和ydiB基因

與刪除aroL基因的方法相同，首先構(gòu)建aroK基因的突變盒。以aKup、aKdn為引物，利用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增大腸桿菌的aroK基因，PCR產(chǎn)物克隆入 pMD18-T-simple載體中，獲得重組質(zhì)粒 pMD-aroK。以上述重組質(zhì)粒為模板用引物Kverp和Kverdn，進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，并克隆入difGm片段得到重組質(zhì)粒pMD-aroK′::difGm。以重組質(zhì)粒 pMD-aroK′::difGm 為模板，用引物aKup和 aKdn進(jìn)行 PCR擴(kuò)增得到片段aroK′::difGm。將片段 aroK′::difGm 電轉(zhuǎn)入 SA1菌中進(jìn)行Red-Xer重組，實(shí)現(xiàn)aroK基因的突變。ptsG和ydiB基因刪除的技術(shù)路線同上。

1.3 搖瓶培養(yǎng)

將保藏在?70 ℃甘油管中的菌體劃線在固體平板上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后接單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)9 h作為種子培養(yǎng)液。用種子培養(yǎng)液收集適量菌體，以發(fā)酵培養(yǎng)基重懸后在37 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔2 h取樣測OD600，確定菌株生長情況。用生物傳感儀測量發(fā)酵液中葡萄糖殘留量，從而確定菌體消耗葡萄糖的情況。為了防止在培養(yǎng)過程中菌體產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH降低從而影響菌體的生長，可在培養(yǎng)過程添加適量的碳酸鈣進(jìn)行中和。本研究中所有發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，檢測數(shù)據(jù)取平均值進(jìn)行分析。

1.4 發(fā)酵及代謝物分析

細(xì)胞密度用紫外可見分光光度計在 600 nm波長處測定，細(xì)胞干重 (DCW) 是由 DCW 與OD600測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到，本實(shí)驗(yàn)所用菌株CICIM B0013的細(xì)胞干重 (DCW)與OD關(guān)系為：1 OD600=0.38 g/L DCW[16]。培養(yǎng)基中的葡萄糖用生物傳感儀 (SBA40C)(山東省科學(xué)院生物研究所)檢測。

莽草酸、奎寧酸、丙酮酸、以及乙酸和乳酸等有機(jī)酸用高效液相色譜分析。取1.5 mL的發(fā)酵上清液加入等體積的 10%的三氯乙酸混合均勻，4 ℃放置2 h沉淀雜質(zhì)蛋白 (測定胞內(nèi)有機(jī)酸時先用超聲波破碎細(xì)胞后按前述方法處理)，室溫12 000 r/min離心8 min，上清液經(jīng)0.45 μm的膜過濾后，用高效液相的方法測定發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物含量。

高效液相色譜分析條件：色譜柱為 Aminex HPX-87H column (300 mm×7.8 mm；9 μm)，流動相為0.005 mol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，測量停留時間為20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因刪除

2.1.1 aroL基因的刪除與鑒定

首先用 1.2.1的方法構(gòu)建關(guān)鍵重組質(zhì)粒pMD-aroL′::difGm，該質(zhì)粒大小為4 057 bp，物理圖片如圖3A所示。將該重組質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，獲得2.7 kb和1.3 kb左右的兩條電泳條帶，見圖3B。

圖3 重組質(zhì)粒 pMD-aroL’::difGm 的物理圖譜 (A)及酶切驗(yàn)證 (B)Fig. 3 Map of recombinant vector pMD-aroL′::difGm(A) and identification by restriction enzyme (B). 1:pMD-aroL’::difGm/EcoR I; M: DNA marker.

以重組質(zhì)粒pMD-aroL′::difGm為模板，PCR擴(kuò)增獲得aroL基因的突變盒aroL′::difGm，經(jīng)純化后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主菌 B0013/pKD46后涂布于慶大霉素抗性篩選平板上，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于無抗性的LB培養(yǎng)基平板上傳代培養(yǎng)，最后用引物YL、aLdn進(jìn)行菌落 PCR驗(yàn)證，原始菌株獲得aroL基因 (片段大小為 575 bp)，轉(zhuǎn)化子 SA1(aroL′::difGm)獲得片段 aroL′::difGm (大小為1.3 kb左右)，其慶大霉素抗性基因 (Gm)丟失后，轉(zhuǎn)化子SA1 (aroL′::dif)獲得大小為365 bp的aroL′::dif片段 (圖4)。表明aroL基因已經(jīng)被成功敲除。

2.1.2 aroK、ptsG和ydiB基因的刪除與鑒定

利用相似的策略刪除 aroK基因。首先構(gòu)建aroK刪除片段aroK′::difGm并將其電轉(zhuǎn)入宿主菌SA1/pKD46中。挑取轉(zhuǎn)化子后，用引物YK、aKdn進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，出發(fā)菌株 SA1獲得657 bp大小電泳圖譜；轉(zhuǎn)化子SA1 (aroK::difGm)獲得1.4 kb左右的電泳圖譜；其抗生素抗性基因丟失后，轉(zhuǎn)化子SA2獲得356 bp大小電泳圖譜(圖4)。即菌株SA1的aroK部分基因已被dif序列替換。

利用相似的策略進(jìn)行刪除 ptsG基因。首先構(gòu)建刪除片段ptsG′::difGm并將其電轉(zhuǎn)入宿主菌SA1/pKD46中。以引物YG和pGdn進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，ptsG基因的大小為1.4 kb，整合到染色體DNA上的ptsG′::difGm片段大小為1.7 kb，經(jīng)dif重組而丟掉Gm基因的轉(zhuǎn)化子SA3的PCR結(jié)果為0.5 kb (ptsG′::dif的大小)，鑒定電泳圖譜見圖4，表明ptsG基因已經(jīng)被成功敲除。

圖4 大腸桿菌基因刪除的PCR鑒定Fig. 4 Identification of genes knockout in E. coli. by PCR M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of aroL gene; 2:PCR product of aroL′::difGm; 3: PCR product of aroL′::dif; 4: PCR product of aroK gene; 5: PCR product of aroK′::difGm; 6: PCR product of aroK′::dif; 7: PCR product of ptsG gene; 8: PCR product of ptsG′::difGm; 9: PCR product of ptsG′::dif; 10: PCR product of ydiB gene; 11: PCR product of ydiB′::difGm; 12: PCR product of ydiB′::dif.

構(gòu)建用于刪除 ydiB基因的基因突變盒ydiB′::difGm并導(dǎo)入SA3細(xì)胞后，利用引物YB、yBdn進(jìn)行菌落 PCR驗(yàn)證。ydiB基因的大小為0.6 kb，ydiB基因片段的大小 1.3 kb左右，經(jīng)dif-dif重組而丟掉Gm基因的轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為0.3 kb左右 (ydiB′::dif的大小)。鑒定電泳圖譜見圖4，表明ydiB基因已經(jīng)被成功敲除。

2.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 代謝工程菌的細(xì)胞生長和底物利用性能評價

分別考察出發(fā)菌 B0013和系列突變株(SA1、SA2、SA3和SA4)的細(xì)胞生長、葡萄糖消耗和莽草酸合成情況。

由圖5可以看出，在發(fā)酵初期的4 h內(nèi)，突變株與對照菌株的生長速度沒有顯著區(qū)別，但整個發(fā)酵周期來看代謝工程菌的對數(shù)生長期顯著延長，并且SA3和SA4菌株更為突出，對數(shù)生長期達(dá)到了10 h。同時，表3表明，盡管出發(fā)菌株的比生長速率高于代謝工程菌株，但出發(fā)菌株的最終的細(xì)胞生物量僅為2.84 g/L，明顯低于其余4株基因缺失突變株，其中SA4菌株的最大生物量較高，達(dá)到了5.71 g/L。有趣的是，隨著基因的疊加刪除，突變株的SA1、SA2、SA3和SA4最大細(xì)胞生物量也呈現(xiàn)出依次升高的趨勢，分別達(dá)到3.45 g/L、3.94 g/L、5.24 g/L和5.71 g/L (圖5，表 3)。由此可見，基因刪除不僅影響大腸桿菌的細(xì)胞生長性能，對最終細(xì)胞生物量也產(chǎn)生了明顯的影響。

圖5 大腸桿菌B0013及其基因缺失突變株的細(xì)胞生長過程Fig. 5 Growth curve of B0013 and its SA-producing derivatives.

進(jìn)一步考察了突變株及對照菌株的底物利用情況，結(jié)果如圖6和表3所示。與突變株相比，出發(fā)菌株的葡萄糖利用速度最快，結(jié)合菌體生長情況可以看出，出發(fā)菌株的細(xì)胞快速生長可能是葡萄糖快速利用所引起的。與出發(fā)菌株相比，4株突變株在達(dá)到生長穩(wěn)定期以后葡萄糖消耗速度下降更為顯著，至發(fā)酵結(jié)束時，SA1菌株才基本利用完葡萄糖，而其余3株突變株的發(fā)酵液中均有不同程度的葡萄糖殘余，其中SA3菌株的發(fā)酵液中的殘余葡萄糖達(dá)到5 g/L左右。結(jié)合代謝工程菌的生長性能可以看出，刪除莽草酸途徑中的aroK和aroL基因在一定程度上降低了細(xì)胞對葡萄糖的利用速率，而 ptsG基因的刪除對抑制細(xì)胞的葡萄糖利用效率更為顯著。另一方面，發(fā)酵過程中細(xì)胞的快速生長和葡萄糖的快速利用對細(xì)胞的代謝活力要求較高，并且需要較高的溶氧水平。同時，分析了不同菌株發(fā)酵液的丙酮酸和乙酸 (數(shù)據(jù)未顯示)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株中的乙酸和丙酮酸等有機(jī)酸的含量明顯高于代謝工程菌，發(fā)酵液的pH相對較低，而SA2菌株的發(fā)酵液中丙酮酸水平顯著高于 SA3菌株，SA4發(fā)酵液中含有一定濃度的乙酸?？梢酝茰y，出發(fā)菌株的高生長速率和低細(xì)胞生物量可能是由于培養(yǎng)過程中溶氧的限制導(dǎo)致有機(jī)酸的積累，從而限制了細(xì)胞后期的生長，而 ptsG基因的刪除部分阻斷了PEP依賴型的PTS系統(tǒng)，使得細(xì)胞的葡萄糖利用效率降低，一方面導(dǎo)致了菌體的生長緩慢，另一方面減少了PEP到丙酮酸的轉(zhuǎn)化。

圖6 大腸桿菌B0013及其基因缺失突變株的葡萄糖利用過程Fig. 6 Glucose consumption in B0013 and its SA-producing derivatives.

2.2.2 基因刪除對莽草酸及中間產(chǎn)物合成的影響

分別考察了突變株及其出發(fā)菌株的莽草酸合成能力，培養(yǎng)48 h后發(fā)酵液中的莽草酸含量最高，結(jié)果如圖7和表3所示。對照菌株B0013的莽草酸合成和累積水平最低，發(fā)酵液中幾乎檢測不到，說明大腸桿菌的莽草酸代謝受到細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)控。通過刪除 aroL基因部分阻斷了莽草酸代謝的下游途徑后，菌株SA1莽草酸產(chǎn)量較出發(fā)菌有所提高，完全阻斷莽草酸激酶反應(yīng) (刪除aroL和aroK基因)，SA2發(fā)酵液中莽草酸含量達(dá)到67 mg/L。PEP作為莽草酸合成的前體，對細(xì)胞的莽草酸合成水平起著重要的調(diào)節(jié)作用，較高的 PEP前體可以有效提高目的產(chǎn)物的合成和積累。為考察PEP的累積對莽草酸的影響，在刪除aroL、aroK基因基礎(chǔ)上進(jìn)一步刪除了ptsG基因構(gòu)建了PTS部分缺失的突變株，該突變株主要利用葡萄糖協(xié)助蛋白和葡萄糖激酶組成的非 PEP供能的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，可以節(jié)約大量的 PEP用于莽草酸的合成。發(fā)酵結(jié)果顯示，突變株SA3的莽草酸合成能力顯著提高，發(fā)酵液中累積水平達(dá)到417 mg/L，相比于阻斷莽草酸激酶反應(yīng)，提高PEP前體對莽草酸合成和積累效果更為顯著。在突變株 SA3的基礎(chǔ)進(jìn)一步刪除了莽草酸/奎寧酸脫氫酶基因 (ydiB)，莽草酸最終產(chǎn)量達(dá)到576 mg/L，較出發(fā)菌株莽草酸產(chǎn)量為6 mg/L提高了90多倍。

同時，研究發(fā)現(xiàn) ydiB基因的刪除能夠有效減少奎寧酸 (QA)合成和積累，發(fā)酵結(jié)束時SA3菌株的發(fā)酵液中QA的含量為128 mg/L，而敲除了 ydiB基因的 SA4突變株的 QA濃度僅為37 mg/L (表3)。由表3可知，盡管疊加刪除基因后的突變菌株較出發(fā)菌株的細(xì)胞生物量逐步提高，至最終重組菌SA4在發(fā)酵液中菌體濃度達(dá)到5.71 g/L，莽草酸的產(chǎn)量也顯著提高，但考慮到葡萄糖利用和發(fā)酵時間，莽草酸的產(chǎn)率和生產(chǎn)強(qiáng)度相對較低。

圖7 不同菌株莽草酸產(chǎn)量比較Fig. 7 Comparision of shikimic acid production comparison in different strains.

表3 搖瓶發(fā)酵參數(shù)比較Table 3 Comparison of parameters in shake-flask experiments

3 討論

本文通過連續(xù)刪除大腸桿菌的aroL、aroK、ptsG和ydiB等4個基因獲得了能夠合成積累一定濃度莽草酸的代謝工程菌株。通過刪除 aroL和 aroK基因能夠提高細(xì)胞的莽草酸積累水平，但是由于芳香族氨基酸是細(xì)胞生長必需的，因此必須向培養(yǎng)基中添加適量的3種芳香族氨基酸后才能保證突變株的正常生長。ptsG基因刪除使得細(xì)胞的PTS系統(tǒng)部分缺失，導(dǎo)致了細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由PEP供能形式改變?yōu)锳TP供能形式，從而菌體前期由于沒有足夠的能量供給而生長較慢，對數(shù)生長期延長，同時使得最終菌體濃度得到提高。另一方面，敲除 ptsG基因后，PTS系統(tǒng)并未完全失活，還存在著甘露糖依賴的EIIABCDMan系統(tǒng)，該葡萄糖運(yùn)輸途徑依然需要PEP的參與，同時大腸桿菌還存在非PTS系統(tǒng)的葡萄糖運(yùn)輸途徑 (如半乳糖:H+-葡萄糖激酶系統(tǒng)等)，但這些葡萄糖運(yùn)輸途徑的活性相對較低，也是導(dǎo)致葡萄糖代謝速率變慢，從而影響了底物利用效率和細(xì)胞生物量的原因之一[17]。更重要的是ptsG基因的缺失避免了PEP的過度消耗，為莽草酸合成和積累提供了更多的前體，因此能夠顯著提高細(xì)胞的莽草酸合成和積累能力。奎寧酸是莽草酸合成途徑中的主要副產(chǎn)物，該副產(chǎn)物的形成不僅降低了莽草酸的產(chǎn)量和得率，更重要的是給下游的莽草酸分離提取工藝帶來了較大的不便。刪除 ydiB基因不僅降低了副產(chǎn)物奎寧酸的生成，同時顯著提高了莽草酸的積累。

利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)莽草酸成為近幾年來國際上解決莽草酸需求的熱點(diǎn)。事實(shí)上，微生物合成莽草酸的主要受限步驟是PEP和E4P的利用率[18]。自1885年，Eykman首次從莽草中分離出莽草酸以來，國際上對它的研究就一直沒有停止過[19]。Frost課題組針對大腸桿菌過量合成莽草酸的代謝工程開展了系統(tǒng)研究，在刪除相關(guān)基因的基礎(chǔ)上過量表達(dá)glf、glk、aroFFBR、tktA和 aroE基因，獲得的代謝工程菌的莽草酸合成水平在10 L發(fā)酵罐中達(dá)到87 g/L，莽草酸得率為0.36 mol/mol[20]，這是迄今報道最高的莽草酸生產(chǎn)水平。楊婕等[21]在E. coli JM83的基礎(chǔ)上敲除aroL基因并游離表達(dá)了aroG、ppsA和tktA等3個基因，搖瓶水平下莽草酸產(chǎn)量達(dá)到 94 mg/L，國內(nèi)還未見有利用代謝工程菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的相關(guān)報道。本文構(gòu)建的代謝工程菌的莽草酸產(chǎn)量為568 mg/L，相比國外研究水平依然有很大差距。為了進(jìn)一步提高莽草酸產(chǎn)量，還可以進(jìn)行以下嘗試：一是通過過量表達(dá)關(guān)鍵酶基因提高細(xì)胞的莽草酸代謝能力；二是提高莽草酸上游代謝途徑的底物利用率；三是降低產(chǎn)莽草酸過程的副產(chǎn)物的形成。

[1]Bongaerts J, Kr?mer M, Müller U, et al. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metab Eng,2001, 3(4): 289?300.

[2]Ma Y, Sun JN, Xu QP, et al. Inhibitory effects of shikimic acid on platelet aggragation and blood coagulation. Acta Pharmac Sin, 2000, 30(1): 1?3(in Chinese).馬怡, 孫建寧, 徐秋萍, 等. 莽草酸對血小板聚集和凝血的抑制作用. 藥學(xué)學(xué)報, 2000, 30(1):1?3.

[3]Liu YY, Liao XF. Research progress in shikimic acid. Chem Ind Times, 2007, 27(3): 54?57 (in Chinese).劉永友, 廖曉峰. 莽草酸的研究進(jìn)展. 化工時刊,2007, 27(3): 54?57.

[4]Abbott A. Avian flu special: what's in the medicine cabinet? Nature, 2005, 435(7041): 407?409.

[5]Herrmann KM, Weaver LM. The shikimate pathway. Ann Rev Plant Biol, 1999, 50(1):473?503.

[6]Richards TA, Dacks JB, Campbell SA, et al.Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell,2006, 5(9): 1517?1531.

[7]Johansson L, Lindskog A, Silfversparre G, et al.Shikimic acid production by a modif i ed strain of E.coli (W3110. shik1)under phosphate-limited and carbon-limited conditions. Biotechnol Bioeng,2005, 92(5): 541?552.

[8]Knop DR, Draths KM, Chandran SS, et al.Hydroaromatic equilibration during biosynthesis of shikimic acid. J Am Chem Soc, 2001, 123(42):10173?10182.

[9]Wang H, Cui ZF. Regulation of shikimic acid biosynthesis pathway. Biotechnol Bull, 2009(3):50?53 (in Chinese).汪華, 崔志峰. 莽草酸生物合成途徑的調(diào)控. 生物技術(shù)通報, 2009(3): 50?53.

[10]Ghosh S, Chisti Y, Uttam C, et al. Production of shikimic acid. Biotechnol Adv, 2012, 3(1): 1?7.

[11]Chen PT, Chang CJ, Wang JY, et al. Genomic engineering of Escherichia coli for production of intermediate metabolites in the aromatic pathway. J Taiwan Inst Chem Eng, 2011, 42(1): 34?40.

[12]Chaveroche MK, Ghigo JM, d’Enfert C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acid Res, 2000, 28(22): 97?103.

[13]Bloor AE, Cranenburgh RM. An efficient method of selectable marker gene excision by Xer recombination for gene replacement in bacterial chromosomes. Appl Environ Microbiol, 2006,72(4): 2520?2525.

[14]Chen R, Yap WM, Postma PW, et al. Comparative studies of Escherichia coli strains using different glucose uptake systems: metabolism and energetics.Biotechnol Bioeng, 1997, 56(5): 583?590.

[15]Zhou L, Niu DD, Li N, et al. Multiple gene inactivation approach in Escherichia coli mediated by a combination of red recombination and xer recombination. Microbiol China, 2010, 37(6):923?928 (in Chinese).周麗, 牛丹丹, 李寧, 等. 基于 Red重組系統(tǒng)和Xer重組系統(tǒng)的大腸桿菌多基因刪除方法. 微生物學(xué)通報, 2010, 37(6): 923?928.

[16]Zhou L, Zuo ZR, Chen XZ, et al. Evaluation of genetic manipulation strategies on D-Lactate production by Escherichia coli. Curr Microbiol,2011, 62(3): 981?989.

[17]Gosset G. Improvement of Escherichia coli production strains by modification of the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system. Microbi Cell Factor, 2005, 4(1): 14 doi:10.1186/1475-2859-4-14.

[18]Ahn JO, Lee HW, Saha R, et al. Exploring the effects of carbon sources on the metabolic capacity for shikimic acid production in Escherichia coli using in silico metabolic predictions. Microbiol Biotechnol, 2008, 18(11): 1773?1784.

[19]Jiang SD, Singh G. Chemical synthesis of shikimic acid and its analogues. Tetrahedron Lett, 1998,54(499): 4697?4733.

[20]Chandran SS, Yi J, Draths KM, et al.Phosphoenolpyruvate availability and the biosynthesis of shikimic acid. Biotechnol Prog,2003, 19(3): 808?814.

[21]Yang J, Qian J, Ye J, et al. Genetic manipulation of the genes related with shikimate metabolism of Escherichia coli. J East China Univ: Sci Technol,2009, 35(2): 207?212 (in Chinese).楊捷, 錢晉, 葉江, 等. 大腸桿菌莽草酸生物合成途徑的基因操作. 華東理工大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2009, 35(2): 207?212.