用重組8型腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型評價核苷類似物的抗病毒效果

王國婧，王剛，董小巖，田文洪，尉遲捷，魏國超，孟紅，吳小兵

1 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250000

2 中國疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 100052

3 北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所，北京 100176

4 吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012

5 北京亦莊國際生物醫(yī)藥投資管理有限公司，北京 100111

乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科，是引起病毒性乙型肝炎的病原體[1]。全球約 1/3的人曾感染過 HBV，慢性HBV感染者約3～4億，其中25%～40%人死于HBV感染相關(guān)性疾病[2]。我國屬于 HBV感染的高流行區(qū)，一般人群的 HBsAg陽性率接近10%[3]。對現(xiàn)有病毒性乙型肝炎患者及 HBsAg攜帶者的防治工作，在今后幾十年里仍是一項艱巨的任務(wù)。

目前，治療乙型肝炎的藥物主要包括核苷酸類似物和干擾素等[4]，其中以核苷酸類似物臨床應(yīng)用最廣泛[5]。由于HBV耐藥突變株不斷出現(xiàn)[6]，使得現(xiàn)有抗 HBV藥物難以達到理想的治療效果，因此需要研發(fā)新的藥物。而新型乙肝藥物的篩查鑒定需要合適的HBV動物模型。因小鼠容易獲得、研究背景清楚、經(jīng)濟實用等優(yōu)點，HBV相關(guān)小鼠模型是理想的新型乙肝治療藥物的篩選動物模型。

2010年本課題組利用高嗜肝性 8型重組腺相關(guān)病毒攜帶1.3個拷貝的HBV基因組 (ayw亞型)(Recombinant adeno-associated virus type 8 carrying 1.3 copies of HBV genome (ayw),rAAV8-1.3HBV)，體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)C57BL/6小鼠，成功制備乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型[7]。該模型與HBV轉(zhuǎn)基因小鼠類似，小鼠體內(nèi)可持續(xù)檢測到HBeAg和HBsAg的表達以及HBV DNA的復(fù)制。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型已廣泛應(yīng)用于治療病毒性乙型肝炎核苷酸類似藥物的篩選和評價。為探討該模型是否也可用于新型核苷酸類抗 HBV藥物篩選和評價，本研究選用目前臨床治療病毒性乙型肝炎最常用的兩種核苷酸類似物 (拉米夫定和恩替卡韋)作用于該模型，對比給藥前后及停藥前后小鼠血清學(xué) HBV DNA、HBeAg、HBsAg檢測指標(biāo)的變化情況，判斷此模型能否反映核苷類藥物的抗HBV效果。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡雄性C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；乙型肝炎病毒 (HBV)核酸定量檢測試劑盒 (PCR-熒光探針法) (國藥準(zhǔn)字 S20020033)購自深圳匹基生物有限公司；HBeAg、HBsAg定性診斷試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；HBeAg、HBsAg定量檢測試劑盒購自美國Abbott公司；恩替卡韋片 (國藥準(zhǔn)字H20052237)購自中美上海施貴寶制藥有限公司；拉米夫定片 (國藥準(zhǔn)字 H20030581)購自葛蘭素史克公司。

1.2 重組病毒rAAV8-1.3HBV的制備

重組腺相關(guān)病毒 rAAV8-1.3HBV由北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所制備和提供。主要步驟為：用pAAV2neo-1.3HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細胞后，800 μg/mL G418培養(yǎng)基選擇培養(yǎng) 15 d，得到BHK21/AAV-1.3HBV細胞；用攜帶rep2cap8基因的重組單純皰疹病毒 (MOI=1～5)感染BHK21/AAV-1.3HBV細胞，72 h收獲病變細胞以及培養(yǎng)上清液，按照吳小兵等報道的AAV載體純化方法[8]進行粗純化，之后使用離子交換柱層析方法進一步純化，點雜交方法測定病毒滴度。

1.3 動物模型

將 rAAV8-1.3HBV病毒經(jīng)尾靜脈注射至30只 C57BL/6小鼠體內(nèi)。注射劑量為 1×1011vg/200 μL/只。注射病毒14、28和42 d后，分別小鼠尾靜脈采血，分離血清，測定血清中 HBeAg和HBsAg表達水平以及HBV DNA拷貝數(shù)，判斷模型構(gòu)建成功與否。

1.4 熒光定量PCR檢測血清HBV DNA

病毒注射后第42天、實驗過程中第5天、第10天、第25天4個時間點尾靜脈取血，分離血清，按照乙型肝炎病毒 (HBV)核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒的說明書檢測小鼠血清HBV DNA表達水平。

1.5 ELISA檢測小鼠血清HBeAg、HBsAg

病毒注射第14天和第28天后分別尾靜脈取血，分離血清，去離子水稀釋 20倍后，用萬泰公司 HBeAg、HBsAg診斷試劑盒檢測小鼠血清HBeAg和HBsAg表達水平，檢測過程參見試劑盒說明書。兩項指標(biāo)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)均為樣品OD450≥陰性對照孔平均值×2.1。

病毒注射第 42天以及實驗第 10天和第 25天后分別尾靜脈取血，分離血清，生理鹽水稀釋40倍后，用Abbott公司的HBeAg、HBsAg定量檢測試劑盒檢測小鼠血清HBeAg和HBsAg表達水平，檢測過程參見試劑盒說明書。陽性參考值分別為：HBeAg (S/CO)＞1，HBsAg (mIU/mL)＞0.05。

1.6 實驗設(shè)計

整個實驗流程如圖1所示，分為建立、篩選慢性HBV感染小鼠模型并對該模型的成模率進行評價，以及評價核苷酸類似物藥物作用效果兩個階段。具體如下所述。

1.6.1 實驗分組

根據(jù)病毒注射第14天和第28天后每只小鼠的 HBeAg、HBsAg表達定性檢測結(jié)果，以及第42天 (藥物處理0 d) 后HBeAg、HBsAg和HBV DNA的定量檢測結(jié)果，從 30只注射 rAAV8-1.3HBV小鼠中挑選27只小鼠用于后續(xù)實驗。挑選出的27只小鼠各自HBV DNA表達水平都大于1×105IU/mL，HBeAg和HBsAg在第14天和第 28天時的定性檢測均為陽性，且第 42天時HBeAg、HBsAg和HBV DNA的定性檢測結(jié)果都較高。用隨機數(shù)表法，對挑選出的 27只模型小鼠進行分組，其中空白對照組 (Untreated) 5只、生理鹽水組 (NS) 4只、ETV高劑量組(1.0 mg/(kg?d))5只、ETV低劑量組 (0.1 mg/(kg?d))4只、LAM高劑量組 (500 mg/(kg?d))5只、LAM低劑量組 (100 mg/(kg?d))4只。

1.6.2 藥品

恩替卡韋、拉米夫定研成粉末，損失量以每片20%計算，生理鹽水配置藥品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 處理

根據(jù) 1.6.1中小鼠模型分組時設(shè)定的每組給藥種類和劑量給藥。每組小鼠以灌胃方式連續(xù)給藥10 d (第1～10天)，每日1次，之后停藥15 d(第11～25天)。實驗過程中，第0天、第5天、第10天和第 25天，分別尾靜脈采血，分離血清，?20 ℃保存?zhèn)溆谩５?25天采血后，處死全部小鼠。

1.6.4 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 實驗流程示意圖Fig. 1 The schematic map of procedure for experiment. In the whole of experiment process, mouse model of HBV chronic infection was firstly established by injection of rAAV8-1.3HBV and determination of model. Then suitable models were chosen, different kinds of drugs were given and effects of drugs on model were assessed.

采用成組 t檢驗分析相對應(yīng)時間點 (0 d、10 d和25 d)給藥組與NS組的血清學(xué)HBV DNA表達水平統(tǒng)計學(xué)差異；采用配對t檢驗分析給藥組給藥前后和停藥前后的HBV DNA表達水平的統(tǒng)計學(xué)差異。HBeAg、HBsAg定量檢測兩項指標(biāo)分別采用成組 t檢驗分析相對應(yīng)時間點 (0 d、10 d和25 d)給藥組與NS組的統(tǒng)計學(xué)差異；采用配對t檢驗分析給藥組給藥前后和停藥前后的統(tǒng)計學(xué)差異。以上分析過程均采用 SPSS16.0軟件分析完成。

2 結(jié)果

2.1 小鼠成模情況

將 rAAV8-1.3HBV病毒經(jīng)尾靜脈注射至 30只C57BL/6小鼠體內(nèi)，第14天和第28天后分別對30只小鼠采血并定性檢測 HBeAg和HBsAg表達水平。結(jié)果顯示，第14天除11號、25號小鼠HBeAg檢測結(jié)果為陰性外，其余小鼠均為陽性；30只小鼠HBsAg檢測結(jié)果均為陽性。第28天除25號小鼠HBeAg檢測結(jié)果為陰性外，其余小鼠均為陽性；同時各小鼠 HBsAg檢測結(jié)果均為陽性。第 42天定量檢測小鼠血清學(xué) HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表達水平，結(jié)果如圖2所示。30只小鼠血清學(xué) HBV DNA表達情況(lg (IU/mL))，除11號小鼠為4.13，25號小鼠為3.85，28號小鼠為4.46以外，其余27只小鼠均大于 5.00，平均值為 5.38±0.34。進一步定量檢測小鼠血清HBeAg及HBsAg的表達情況。以上3只血清HBV DNA表達水平較低的小鼠情況如下：11號小鼠HBeAg表達為2.00 S/CO，HBsAg表達為23.07 mIU/mL；25號小鼠HBeAg表達為1.13 S/CO，HBsAg表達為8.10 mIU/mL；28號小鼠HBeAg表達為8.27 S/CO，HBsAg表達為81.54 mIU/mL。其他27只小鼠血清HBeAg平均值 13.22±1.78 S/CO，最低值為 9.50 S/CO；HBsAg平均值 93.24±7.24 mIU/mL，最低值為81.69 mIU/mL。結(jié)合血清HBV DNA表達水平及HBeAg、HBsAg情況，在 30只小鼠中剔除 11號、25號、28號小鼠，挑選其他27只小鼠用于后續(xù)實驗。

2.2 藥物處理對小鼠模型血清HBV DNA的影響

圖2 HBV慢性感染小鼠模型的確定Fig. 2 Determination of mouse model of HBV chronic infection. Thirty mice were injected with rAAV8-1.3HBV. Forty-two days post-injection, HBsAg, HBeAg,and HBV DNA titer in sera were assayed. Mouse whose HBV DNA, HBsAg (40-fold diluted), and HBeAg(40-fold diluted)titer in sera was separately more than 5.00 (lg(IU/mL)), 81.00 mIU/mL, and 9.50 S/CO was determined as model. Twenty-seven mice were chose as models. The hollow circles indicated the mouse model of HBV chronic infection; the solid circles indicated the mice which were not determined as models.

rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型成功建立后，按照 ETV高、低劑量分別給藥10 d后停藥15 d，尾靜脈取血檢測血清學(xué)HBV DNA的變化情況，結(jié)果見表1。相同時間點ETV低劑量組與生理鹽水組對比分析，發(fā)現(xiàn)給藥10 d后相比于生理鹽水組，ETV低劑量組血清學(xué)HBV DNA表達水平下降顯著，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。不同時間點 ETV低劑量組組內(nèi)對比(圖3)，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué)HBV DNA表達水平 (lg (IU/mL))由 5.31±0.42下降到4.54±0.46，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；給藥10 d與0 d相比，下降到4.26±0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；停藥15 d與給藥10 d對比，HBV DNA表達水平有所反彈，上升到4.57±0.14，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。

相同時間點血清 HBV DNA表達水平 ETV高劑量組與生理鹽水組對比分析 (表1)，相比于生理鹽水組，ETV高劑量組給藥5 d即出現(xiàn)顯著下降，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；給藥10 d繼續(xù)下降，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；停藥15 d差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)。不同時間點 ETV高劑量組組內(nèi)對比分析 (圖 3)，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué)HBV DNA表達水平(lg (IU/mL))由 5.36±0.36 下降到 4.29±0.18，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；給藥10 d與0 d相比，下降至 3.75±0.21，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；停藥第15天與給藥第10天相比變化甚微，為3.69±0.27。

表1 ETV和LAM分別作用于rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型后不同時間點血清HBV DNA情況Table 1 HBV DNA titer in sera of HBV chronic infection mouse model mediated by rAAV8-1.3HBV at different time points treated with ETV or LAM

圖3 rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型血清中HBV DNA表達隨時間的變化情況Fig. 3 HBV DNA titer in sera of the HBV chronic infectious mice models mediated by rAAV8-1.3HBV at different time points. Mice models of HBV chronic infection were continuously treated by drugs day by day for 10 days. Then drugs were withdrew and lasted for fifteen days. At different time points in the process, HBV DNA titer in sera was tested.

rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型成功建立后，按照LAM高、低劑量分別給藥10 d后停藥15 d，尾靜脈取血檢測血清學(xué)HBV DNA變化情況，結(jié)果如表 1所示。相同時間點LAM 低劑量組與生理鹽水組對比分析，發(fā)現(xiàn)給藥10 d后相比于生理鹽水組，LAM低劑量組血清學(xué)HBV DNA表達水平也顯著下降，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。而不同時間點LAM低劑量組組內(nèi)對比分析，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué) HBV DNA表達水平 (lg (IU/mL))由5.22±0.17下降到 4.91±0.22，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；給藥 10 d與 0 d相比，下降到4.42±0.22，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；停藥15 d后與給藥第10天對比，HBV DNA表達水平反彈，上升到 5.10±0.49，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。

同理，相同時間點血清HBV DNA表達水平LAM 高劑量組與生理鹽水組對比分析 (表 1)，相比于生理鹽水組，LAM高劑量組給藥10 d出現(xiàn)顯著下降，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；停藥15 d差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)。不同時間點LAM高劑量組組內(nèi)對比分析 (圖3)，給藥5 d與0 d相比，血清學(xué)HBV DNA表達水平 (lg (IU/mL))由 5.61±0.42 下降到 4.63±0.40，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；給藥10 d與0 d相比，下降至 4.32±0.32，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；停藥第15天與給藥第10天相比變化甚微，為 4.17±0.28。此外，實驗全程中生理鹽水組略有下降，但各時間點均無統(tǒng)計學(xué)意義，未處理組血清學(xué)HBV DNA表達水平平穩(wěn)，無明顯變化，且相同時間點生理鹽水組和未處理空白組間HBV DNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 藥物處理對小鼠血清中 HBeAg、HBsAg水平的影響

檢測ETV給藥前后和停藥前后血清中HBeAg表達水平，即第 0天、第 10天、第 25天時的HBeAg表達水平，結(jié)果如圖4A所示，所有結(jié)果均為血清40倍稀釋后的測定值。ETV低劑量組第0天時HBeAg表達水平為13.49±1.72 S/CO，給藥10 d后為13.28±1.87 S/CO，停藥15 d后為13.26±1.60 S/CO，實驗全程中HBeAg表達無明顯變化，未見統(tǒng)計學(xué)差異。ETV高劑量組第 0天表達為 12.44±1.93 S/CO，給藥 10 d為13.05±1.74 S/CO，停藥 15 d為 12.55±1.64 S/CO，全程HBeAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，空白對照組、生理鹽水組全程血清HBeAg表達水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型血清中HBeAg、HBsAg表達隨時間的變化情況Fig. 4 HBeAg and HBsAg titer in the HBV chronic infectious mice models mediated by rAAV8-1.3HBV at different time points. (A)The HBeAg titer. (B)The HBsAg titer.

檢測 ETV給藥前后血清中 HBsAg表達水平，即第0天、第10天、第25天時的HBeAg表達水平，結(jié)果如圖4B所示，所有結(jié)果均為血清40倍稀釋后的測定值。ETV低劑量組第0天時HBsAg表達水平為94.43±6.48 mIU/mL，給藥 10 d為 94.10±5.67 mIU/mL，停藥 15 d為91.76±7.71 mIU/mL，實驗全程中HBsAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ETV高劑量組第0天時HBsAg表達水平為90.02±7.42 mIU/mL，給藥10 d為90.01±6.47 mIU/mL，停藥15 d為91.01±6.94 mIU/mL，實驗全程中HBsAg表達也無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。空白對照組、生理鹽水組全程血清 HBsAg表達水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

檢測 LAM給藥前后血清中 HBeAg表達水平，即第0天、第10天、第25天時的HBeAg表達水平，結(jié)果如圖4A所示，所有結(jié)果均為血清40倍稀釋后的測定值。LAM低劑量組第0天時HBeAg表達為14.22±0.91 S/CO，給藥10 d為12.65±2.00 S/CO，停藥 15 d為 13.43±1.41 S/CO，實驗全程HBeAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LAM高劑量組在第0天時HBeAg表達為14.65±1.38 S/CO，給藥 10 d為 14.29±1.82 S/CO，停藥15 d為14.57±1.50 S/CO，實驗全程HBeAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

檢測 LAM給藥前后血清中 HBsAg表達水平，即第0天、第10天、第25天時的HBeAg表達水平，結(jié)果如圖4B所示，所有結(jié)果均為血清 40倍稀釋后的測定值。LAM 低劑量組第 0天時 HBsAg表達為 93.42±9.41 mIU/mL，給藥10 d為 90.99±6.77 mIU/mL，停藥 15 d為92.33±8.35 mIU/mL，實驗全程HBsAg表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LAM高劑量組第0天時 HBsAg表達為 96.61±8.23 mIU/mL，給藥10 d為 93.62±8.73 mIU/mL，停藥 15 d為93.16±6.30 mIU/mL，實驗全程HBsAg表達也無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

小鼠由于缺乏HBV病毒進入及脫殼所需的特異性受體和某些因子，無法直接應(yīng)用感染性乙型肝炎病毒接種的方法制備模型[9]。現(xiàn)有的小鼠模型是借助其他手段將HBV基因組導(dǎo)入到肝臟或者直接利用轉(zhuǎn)基因方法制備的。近來本課題組用攜帶1.3拷貝HBV基因組的重組8型腺相關(guān)病毒 (rAAV8-1.3HBV)成功在具有正常免疫力的 C57BL/6小鼠體內(nèi)建立了 HBV持續(xù)感染模型，該模型在小鼠肝細胞中自發(fā)回復(fù)形成染色體外環(huán)狀閉合HBV基因組DNA，在血清中持續(xù)檢測到HBeAg及HBsAg表達，在肝臟及血清均持續(xù)檢測到HBV DNA。

本實驗應(yīng)用的rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型與現(xiàn)有小鼠模型相比，主要存在以下幾個優(yōu)點。與轉(zhuǎn)基因小鼠相比，該模型應(yīng)用免疫功能正常的成體小鼠，沒有轉(zhuǎn)基因小鼠在胚胎發(fā)育過程中對HBV DNA形成的免疫耐受過程[10-11]；模型制備操作過程簡單可控；模型血清中HBV DNA水平一致性好，各組組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差??；初始建模病毒量高低、建模時間可控。更為重要的是以本研究所用的小鼠模型為基礎(chǔ)，可以很方便地獲得HBV耐藥突變株的動物模型。這有利于研究目前臨床應(yīng)用核苷酸類似物后出現(xiàn)的耐藥突變問題[12]，為耐藥株篩選抗HBV敏感的新藥物。此外，本模型與應(yīng)用水動力方法的建立的HBV小鼠模型[13-14]相比，具有HBV DNA表達穩(wěn)定，水平集中，時間長久，成功率高等優(yōu)點。

基于上述一系列優(yōu)點，對rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型應(yīng)用已上市最常用的兩種核苷酸類似物 (ETV和LAM)，觀察兩藥在該模型中的抗HBV作用效果。ETV是鳥嘌呤核苷類似物，LAM 是胞嘧啶核苷類似物，兩種藥物均通過形成三磷酸鹽形式而表現(xiàn)活性[15-16]，主要作用于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶位點[17-18]。HBV復(fù)制需要利用逆轉(zhuǎn)錄酶以病毒 pg RNA (Pregenomic RNA)為模板逆轉(zhuǎn)錄生成負鏈 DNA (Minusstrand DNA)，然后合成RC DNA (Relaxed circular DNA)和 DSL DNA (Double-stranded linear DNA)[19]。這一步是核苷酸類似物藥物阻斷HBV復(fù)制、產(chǎn)生抗HBV效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗觀察了用藥前后模型小鼠血清HBV DNA、HBeAg、HBsAg的變化情況。

首先初步評估了 rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的小鼠成模情況。在第 14天、第 28天進行血清學(xué)HBeAg及HBsAg定性檢測。在30只小鼠中初步選擇前后兩次檢測兩項指標(biāo)均為陽性的小鼠用于后續(xù)實驗。同時，由第 42天小鼠血清 HBV DNA表達水平 (lg (IU/mL))觀察可見，30只小鼠中27只大于5.0。本實驗中，我們將小鼠血清HBV DNA表達水平 (lg (IU/mL))大于5.0定為陽性模型篩選標(biāo)準(zhǔn)。在 30只小鼠中進一步篩選出 27只作為構(gòu)建成功的小鼠模型。結(jié)合小鼠血清 HBeAg、HBsAg兩項指標(biāo)表達情況分析，被剔除的3只小鼠血清HBeAg、HBsAg的表達水平，明顯低于其余27只小鼠血清HBeAg表達水平的平均值 (13.22±1.78 S/CO)和 HBsAg表達水平的平均值 (93.24±7.24 mIU/mL)。因此，在30只小鼠中最終挑選出27只用于后續(xù)實驗。本次實驗，rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的 HBV持續(xù)感染小鼠模型通過尾靜脈注射的方法構(gòu)建成功，成模率達90%，反映了該模型制備簡單、成模率高的特點。

對已建立的rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染小鼠模型應(yīng)用核苷酸類似物后發(fā)現(xiàn)，ETV及 LAM 兩藥高、低劑量組均對小鼠血清 HBV DNA產(chǎn)生明顯抑制效果。其中，兩種藥物高劑量組對小鼠血清HBV DNA的抑制作用明顯強于低劑量組。給藥過程中隨著給藥時間延長，所有給藥組小鼠模型血清HBV DNA表達水平逐漸下降。給藥停止前，即給藥10 d后，所有給藥組小鼠血清HBV DNA水平下降至給藥全程最低值。整個實驗過程中，未處理組血清HBV DNA水平未觀察到改變。而生理鹽水組血清HBV DNA水平有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能由反復(fù)灌胃刺激引起。此外，無論給藥5 d或10 d后ETV高、低劑量組對小鼠血清HBV DNA抑制效果均強于LAM高、低劑量組，這一現(xiàn)象與兩種藥物在臨床實際應(yīng)用中的情況相符[20-21]。停藥15 d與給藥10 d相比，兩種藥物低劑量組小鼠血清HBV DNA水平出現(xiàn)明顯上升，提示低劑量組出現(xiàn)停藥反彈現(xiàn)象，這也與臨床情況吻合[22]。

與小鼠血清HBV DNA表達水平出現(xiàn)明顯變化形成鮮明對比的是血清ELISA結(jié)果。無論高、低劑量給藥組或生理鹽水組、空白對照組，小鼠血清 HBeAg、HBsAg給藥前后、停藥前后表達穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯改變。這可能是因為核苷酸類似物藥物作用于逆轉(zhuǎn)錄酶位點，能夠有效地抑制以pg RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄過程中DNA的合成，降低新合成的HBV DNA產(chǎn)量。但核苷酸類似物不能夠清除細胞中原有的HBV DNA量，即轉(zhuǎn)錄時需要的模板，也不能夠抑制轉(zhuǎn)錄過程，因此細胞中HBeAg和HBsAg表達過程可能不受核苷酸類似物影響，用藥前后表達水平未見明顯變化。該模型中的這一現(xiàn)象，也與轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用核苷酸類似物后，血清學(xué)HBV DNA明顯下降，HBeAg、HBsAg無明顯變化的現(xiàn)象相類似[23-26]。

對rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV持續(xù)感染的小鼠模型應(yīng)用核苷酸類似物后，小鼠血清 HBV DNA表達水平下降，而血清HBeAg、HBsAg表達水平未見明顯改變。該模型能夠客觀真實地反映現(xiàn)有核苷酸類似物的抗HBV效果，同時具有制備簡單、成模率高的特點，可以作為新的抗HBV核苷酸類似物篩選評價模型進行進一步推廣應(yīng)用。

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