紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌的分離鑒定及抗菌活性菌株的篩選＊

陳昭華，伍 菱，楊秋明，王驥妍，朱敏佳，杜希萍，2，3，4

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門(mén) 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心，福建廈門(mén) 361021;4.廈門(mén)市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門(mén) 361021)

內(nèi)生真菌(endophyte)是指生活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)植物產(chǎn)生明顯病癥的一類(lèi)真菌。不但對(duì)促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)抗逆性起到重要作用，而且許多內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)［1-2］。目前已從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)多種具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、殺蟲(chóng)、免疫抑制、酶抑制劑或激活劑等活性代謝產(chǎn)物，在醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)的生物防治方面都顯示出重要的應(yīng)用價(jià)值［3-6］。

紅樹(shù)植物(mangrove)是熱帶和亞熱帶潮間帶木本植物群落，通常生長(zhǎng)在港灣河口地區(qū)的淤泥灘涂上，是海灘上特有的森林類(lèi)型和重要的生態(tài)系統(tǒng)。由于所處的高溫、高鹽、頻繁潮汐、缺氧、強(qiáng)風(fēng)、強(qiáng)紫外線的獨(dú)特的生存環(huán)境，致使其內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)型豐富多樣且具有不同的生物活性［7-8］，是許多具有各種活性的先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源之一。

本文從福建省廈門(mén)市集美區(qū)紅樹(shù)植物無(wú)瓣海桑(Sonneratia apetala)，海 馬 齒 (Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)的根、莖、葉中分離培養(yǎng)其內(nèi)生真菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)鑒定，了解紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌在不同植物和不同器官上的分布情況;同時(shí)針對(duì)多種指示菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)試，從中篩選出具有抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌，為藥用微生物資源的研究、開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 無(wú)瓣海桑(Sonneratia apetala)，海馬齒(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)3種紅樹(shù)植物的根、莖、葉采集自福建省廈門(mén)市集美紅樹(shù)林區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 4%PDA培養(yǎng)粉，20%海水，2%瓊脂，121℃滅菌20 min。(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 1%蛋白胨，0.5%牛肉膏，0.5%NaCl，2%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 供試指示菌 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)。

1.2 方法

1.2.1 紅樹(shù)內(nèi)生真菌的分離與純化 采用組織塊法進(jìn)行分離［9］。將采集的根、莖、葉在水中沖洗干凈，瀝干水分。將莖用無(wú)菌刀片去除外皮層和木質(zhì)部，取內(nèi)皮層及韌皮部;根去除外皮。用無(wú)菌刀片將上述樣品切成5 mm×5 mm的小塊，依次用75%乙醇溶液浸泡振蕩30 s，2%次氯酸鈉溶液浸泡振蕩3 min進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗3遍，無(wú)菌濾紙吸干表面無(wú)菌水。將表面消毒后的組織塊置于含有終濃度為50 mg/L慶大霉素的PDA平板上，28℃倒置培養(yǎng)。待培養(yǎng)基出現(xiàn)菌落，挑取邊緣菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)純化幾代，得到純化菌株。

1.2.2 菌種鑒定 按照《真菌鑒定手冊(cè)》的方法，將純化菌株接種到PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)，定期觀察并記錄菌落形狀、大小、表面質(zhì)地、生長(zhǎng)速度、是否產(chǎn)色素等，同時(shí)挑取邊緣菌絲于載玻片，在顯微鏡下觀察其菌絲特征及分枝情況、孢子和產(chǎn)孢器結(jié)構(gòu)［10］，并參考《中國(guó)真菌志》［11］進(jìn)行菌株的分類(lèi)鑒定。

1.2.3 抗菌活性測(cè)定 用菌餅法測(cè)定內(nèi)生真菌的抗菌活性［12-13］。用直徑0.6 cm的打孔器在28℃生長(zhǎng)14 d(PDA培養(yǎng)基培養(yǎng))的內(nèi)生真菌菌落邊緣制備菌餅，然后分別將菌餅置于含金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板(指示菌菌懸液的終濃度為105CFU/mL)上，每株內(nèi)生真菌對(duì)3種指示菌分別作2次重復(fù)。制好后的培養(yǎng)皿于37℃恒溫培養(yǎng)1 d后觀察，測(cè)其抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

從采集到的紅樹(shù)植物無(wú)瓣海桑、海馬齒、秋茄中共分離得到25株內(nèi)生真菌(表1)。從表1可以看出，從無(wú)瓣海桑中分離得到的3株菌株全部來(lái)自于葉片。海馬齒中由葉分離出5株，占總菌株數(shù)的56%，比例最高;其次是由莖分離出3株，占總數(shù)的33%;由根分離出1株，占總數(shù)的11%。而秋茄中分離得到比例最高的部位是根，分離到6株，占總數(shù)的46.15%;其次為葉片，分離出5株菌株，占總數(shù)的38.46%;由莖部分離到2株，占總數(shù)的12.38%。由此可見(jiàn)，不同植物和不同部位上分離到的內(nèi)生真菌菌株數(shù)量有較為明顯的差別。

表1 紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌的分離結(jié)果Tab.1 The result of endophytic fungi from mangrove plants

2.2 紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌的種屬分布

本次分離得到的25株內(nèi)生真菌，根據(jù)形態(tài)觀察及分類(lèi)結(jié)果初步鑒定，其中鏈格孢屬7株，曲霉屬6株，根霉屬3株，長(zhǎng)蠕孢屬2株，紅曲霉屬2株，枝頂孢霉屬2株，鐮孢屬1株，待定2株，其具體的種屬分布情況見(jiàn)表2。

從表中可以看出:紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌有一定的種屬多樣性，以鏈格孢屬和曲霉屬為主，分別占菌株總數(shù)的 28.0% 和 24.0% 。

表2 內(nèi)生真菌的種屬分布Tab.2 The groups of endophytic fungi

2.3 抗菌活性內(nèi)生真菌的篩選

表3 內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選Tab.3 Screening of endophytic fungi with antibacterial activities

表4 內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選Tab.4 Screening of endophytic fungi with antibacterial activities

采用菌餅法對(duì)分離到的紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，指示菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌，結(jié)果如表3和表4所示。在分離到的25株內(nèi)生真菌中，有19株菌株對(duì)至少一種指示菌有抑制作用，占分離菌株總數(shù)的76.0%;其中對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌有抑制作用的分別有11株、15株、14株，分別占分離菌株總數(shù)的 44.0%、60.0%、56.0%。有13株菌株可抑制兩種或三種指示菌，占分離菌株總數(shù)的52.0%;其中菌株 BY1、BJ3、BJ1、WY3、QJ4、QG5、QY1和QY2對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏桿菌同時(shí)有抑制作用;QJ3對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌同時(shí)有抑制作用;BY、WY1、QE2和QJ1對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏桿菌同時(shí)有抑制作用。菌株BY1、BY2、QY1和QY2對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)(20 mm﹤抑菌圈≦30 mm)，其抑菌圈分別為 22.5 mm、20.5 mm、24.5 mm 和24.5 mm;菌株 BY4、BJ3、BJ1、WY3、QJ3、QJ4 和 QG5對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱(10 mm﹤抑菌圈≦20 mm)。菌株 WY3、QE1、和 QJ4對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)(30 mm﹤抑菌圈≦40 mm)，其抑菌圈分別為 34.0 mm、33.0 mm 和 32.0 mm;菌株QY1對(duì)大腸埃希氏桿菌的抑制作用最強(qiáng)(30 mm﹤抑菌圈≦40 mm)，其抑菌圈為30.5 mm。由此可見(jiàn)，紅樹(shù)植物中存在著豐富的具有較強(qiáng)的抗菌活性和廣譜的抗菌作用的內(nèi)生真菌。

3 討論

植物內(nèi)生真菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有多方面的應(yīng)用潛力，是個(gè)潛力巨大、尚待開(kāi)發(fā)的微生物新資源［14］。紅樹(shù)植物根、莖、葉中生長(zhǎng)著豐富的內(nèi)生真菌，本文共分離到25株菌，其中，從莖和葉中分離到的內(nèi)生真菌數(shù)量較多，占總菌株數(shù)的72.0%。地上部分的含菌數(shù)高于地下部分，可能是由于植物在其根際會(huì)釋放出某些化學(xué)物質(zhì)，抑制了根際微生物生長(zhǎng)的緣故，也可能是由于光合作用的產(chǎn)物較多的集中于葉以及莖中，未能良好的向根部傳遞。紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌的種屬分布和抗菌活性篩選實(shí)驗(yàn)表明，紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌不僅種屬分布廣泛，而且具有良好的抗菌活性，是尋求抗菌藥物的寶貴資源。HPLC分析也發(fā)現(xiàn)，這些具有抗菌活性內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物類(lèi)型豐富，采用活性跟蹤法對(duì)其抗菌活性化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定正在進(jìn)一步進(jìn)行中。

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