西方馬腦炎核酸疫苗表達(dá)載體構(gòu)建及免疫原性研究＊

馬金柱，王化磊，鄭學(xué)星，吳紅霞，趙永坤，王鐵成，楊松濤＊，夏咸柱，3＊

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

西方馬腦炎病毒(western equine encephalomyelitis virus，WEEV)能夠引起人畜共患急性傳染性腦炎，呈現(xiàn)病死率高，病愈后多留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等顯著特點(diǎn)，已經(jīng)引起世界各國高度重視，被列為二類生物恐怖試劑［1-4］。WEEV最早發(fā)現(xiàn)于1930年，從美國加州默克郡的馬腦內(nèi)被分離［5］。之后，加拿大、美國和墨西哥等國都有WEEV發(fā)生報道。我國于1990年分別從新疆烏蘇縣的一組赫坎按蚊和博樂縣的全溝硬蜱中分離出WEEV［6］。WEEV主要以蚊蟲形式傳播，也可通過氣溶膠形式傳播，加之生態(tài)環(huán)境和國際間交流頻率不斷增加給WEEV傳染提供了可能，導(dǎo)致WEEV預(yù)防任務(wù)日益加重。如今，人類主要利用滅活和弱毒疫苗預(yù)防本病，但它們存在許多缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用受限，嚴(yán)重缺乏WEEV高效疫苗研究［7］。研究顯示 WEEV 編碼 C、E3、E2、6K 與 E1 結(jié)構(gòu)蛋白，它們之間能以特定形式組裝成WEEV病毒體，具有較強(qiáng)的免疫原性，可引起機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫［2，8-10］。因此，本研究構(gòu)建成重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1-C-E3-E2-6k-E1，使其用細(xì)胞或機(jī)體表達(dá)WEEV病毒樣粒子而模擬自然狀態(tài)病毒體，研究該重組載體作為核酸疫苗的免疫原性，以為WEEV新型疫苗研究提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒與小鼠CD8、CD4、CD3流式單克隆抗體購于RD公司;Qiagen公司質(zhì)粒提取試劑盒;核酸內(nèi)切酶 Hind III和 Not I、T4連接酶、DNA Marker、HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG和羊抗鼠FITC標(biāo)記二抗均購自大連寶生物工程有限公司;Invitrogen Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑;鼠源WEEV單克隆抗體購于millipore公司，NEB公司高保真DNA聚合酶。

1.2 細(xì)菌、質(zhì)粒、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物

感受態(tài)細(xì)胞 (E.coli BL21)，pcDNA3.1載體與pVL1393-C-E3-E2-6k-E1(載體上含有C-E3-E2-6k-E1全基因序列，簡寫pVL1393-C-E)重組質(zhì)粒及293T細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所保存。動物實(shí)驗(yàn)采用潔凈級BALB/c小鼠，小鼠為5-6周齡雌性小鼠，體重為10-15 g，由長春生物制品所提供。

1.3 重組表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)Genbank中編碼全基因CE3-E2-6k-E1序列，利用DNAStar軟件設(shè)計一對擴(kuò)增編碼全基因特異性引物，引物兩端分別加上酶切位點(diǎn)Hind III和Not I的堿基序列(下劃線所示)，經(jīng)分析引物具有很好的特異性。引物序列如下:

將以上序列郵寄上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行引物合成。

1.3.2 目的基因獲得 以提取重組質(zhì)粒pVL1393-C-E為模板PCR擴(kuò)增3711 bp片段。PCR反應(yīng)體系組成如下:DNA 模板 1μL，10 × PCR 緩沖液2μL，上游 引 物 1μL(25μmol/L)和 下 游 引 物 1μL(25μmol/L)，Phusion DNA 高保真聚合酶 0.2μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，去離子水13.8μL，總反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)熱3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 3 min，30 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3μL產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3 酶切與連接及轉(zhuǎn)化 將純化后的PCR產(chǎn)物和 pcDNA3.1載體雙酶切。酶切體系:10×BSA 5μL，Hind III 1μL，Not I 1μL，DNA 12μL，10 × K 緩沖溶液 2.5μL，ddH2O 28.5μL，混勻后，37 ℃ 水浴中酶切3 h。純化后酶切產(chǎn)物連接體系為:SolutionI 2.5μL(含 T4 連接酶)，DNA 5.5μL，載體 2.0μL，16℃連接過夜。最后，按熱休克方法對連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.3.4 重組表達(dá)載體的鑒定 將上述轉(zhuǎn)化菌過夜培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用酶切和基因測序方法鑒定重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-C-E，獲得的重組菌命名為 E.coli BL21 pcDNA3.1-C-E。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

采用含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋70%-80%培養(yǎng)孔底壁時，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-C-E轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后，在37℃、5%CO2條件下細(xì)胞培養(yǎng)48～72 h后，細(xì)胞和細(xì)胞上清液分別用于間接免疫熒光(indirect immunofluorescence，IIF)和電鏡檢測，確定WEEV病毒蛋白或病毒樣粒子是否表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)完畢后，吸掉上清，加入80%預(yù)冷丙酮，-20℃固定2 h，PBS洗滌后，加入一抗(WEEV單克隆抗體)37℃反應(yīng)2 h，PBS洗滌后，加入用0.1%伊文斯蘭稀釋的二抗(羊抗鼠FITC標(biāo)記)，37℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察。電鏡檢測病毒樣粒子時，樣品用磷鎢酸染色。

1.5 動物免疫

取健康雌性BALB/c小鼠24只，隨機(jī)分成3組，每組8只。第1組和第2組分別是PBS免疫組與pcDNA3.1免疫組，第3組是重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CE 免疫組，每組分別注射 100μL PBS、100μL pcDNA3.1 質(zhì)粒(1μg/μL)與重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-C-E 100μL(1μg/μL)。免疫前 72 h 于小鼠股四頭肌肌肉多點(diǎn)注射布比卡因，然后在相同部位進(jìn)行免疫。小鼠共免疫3次，兩次免疫間隔時間為3 w。在每次免疫后第21 d給小鼠采血，用于T細(xì)胞、細(xì)胞因子和抗體水平檢測。

1.6 免疫指標(biāo)檢測

1.6.1 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例檢測 在小鼠2免后第21 d，隨機(jī)取每組小鼠3只，眼眶采血100μL/只，以阿氏液(ACD)作為抗凝劑。用0.83%氯化銨裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌后，用10%小鼠血清封閉免疫細(xì)胞，然后，將細(xì)胞與小鼠CD3+分子單抗(CY3-PE標(biāo)記)、CD4+分子單抗(FITC標(biāo)記)和CD8+分子單抗(PE標(biāo)記)4℃結(jié)合30 min，PBS洗滌后，用流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例。

1.6.2 細(xì)胞因子濃度測定 取二免后第21 d各組小鼠血清，用細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒測定血清中IL-2、IL-4和IFN-γ濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD450nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢測樣品中相應(yīng)細(xì)胞因子的含量，用 SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6.3 IgG抗體水平測定 利用原核系統(tǒng)表達(dá)WEEV的E2蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法，檢測每次免疫以后小鼠血清中E2蛋白抗體水平。封閉液采用1%BSA，底物為 TMB，終止液為2 mol/L H2SO4，E2 蛋白包被濃度是 10μg/mL，一抗為待檢小鼠血清，二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG;一抗37℃反應(yīng)2 h;二抗37℃作用1 h;最后，以450 nm波長測吸光度。以恰好樣品OD值≧陰性血清樣品的OD值+3S(S為標(biāo)準(zhǔn)方差)臨界值時，對應(yīng)血清稀釋度為該樣品血清效價。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增

以提取的pVL1393-C-E重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到一條為3711 bp的條帶，1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 C-E基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 The PCR product of C-E gene

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

pcDNA3.1-C-E質(zhì)粒采用 Hind III和 Not I雙酶切后，經(jīng)過瓊脂糖電泳，紫外光下可見插入片段與目的片段大小相符，酶切之后得到約為3700 bp和5500 bp左右兩條帶，如圖2所示。目的基因測序結(jié)果與GenBank上NC-003908.1基因序列相比較同源性為100%，說明目的片段連接正確。

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果鑒定

圖2 pcDNA3.1-C-E的酶切鑒定Fig.2 The enzyme digestion of pcDNA3.1-C-E

在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)48-72 h后，IIF檢測結(jié)果表明pcDNA3.1-C-E轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中能清晰觀察到綠色熒光，并且熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，相反，pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞和正常培養(yǎng)293T細(xì)胞中未見到綠色熒光，說明pcDNA3.1-C-E能在細(xì)胞中表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)果如圖3所示;另外，電鏡檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中都能見到球形病毒樣粒子(VLP)，具有囊膜結(jié)構(gòu)，VLP直徑在50～70 nm之間，與WEEV大小相符，這進(jìn)一步說明重組質(zhì)粒不僅能在細(xì)胞中表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，而且病毒蛋白能夠組裝成病毒體結(jié)構(gòu)釋放到胞外，結(jié)果如圖4所示。

2.4 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例

用流式細(xì)胞儀檢測單抗標(biāo)記的CD3+T細(xì)胞1×104個，然后分析CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組(pcDNA3.1-C-E載體免疫)小鼠CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例明顯高于對照組，差異均顯著(P＜0.05)，圖5為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例統(tǒng)計分析結(jié)果。

圖4 電鏡檢測結(jié)果Fig.4 The result of detection of the electron microscopy

圖5 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例統(tǒng)計分析Fig.5 The statistics of CD4+T/CD8+T cell

2.5 細(xì)胞因子濃度測定

細(xì)胞因子測定結(jié)果表明2免后第21 d實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中IL-2、IL-4及IFN-γ濃度(pg/mL)都分別明顯高于pcDNA3.1免疫組和 PBS-對照組，差異極顯著(P＜0.01)，說明 pcDNA3.1-C-E 載體具有很強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激小鼠免疫細(xì)胞活化，產(chǎn)生高水平細(xì)胞因子，結(jié)果見圖6-8所示。

圖6 小鼠血清中IL-2含量(M±SD)Fig.6 Concentrations of IL-2 in mice sera(M ± SD)

2.6 IgG水平檢測結(jié)果

圖7 小鼠血清中IL-4含量(M±SD)Fig.7 Concentrations of IL-4 in mice sera(M ± SD)

圖8 小鼠血清中IFN-γ含量(M±SD)Fig.8 Concentrations of IFN-γ in mice sera(M ± SD)

在每次免疫后第21 d采集小鼠血液，分離血清，將每份血清1∶2倍稀釋后，再做2倍倍比稀釋(每組3 只小鼠血清)，即做 1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 與 1∶64 倍稀釋。用間接ELISA方法檢測血清中E2蛋白的IgG水平。結(jié)果顯示1免后實(shí)驗(yàn)組小鼠E2蛋白IgG抗體開始產(chǎn)生，并隨著免疫時間延長，抗體效價逐漸上升，3免后第21 d抗體效價可達(dá)到1∶16，結(jié)果見圖9所示。表明pcDNA3.1-C-E能夠明顯刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫。

圖9 免疫鼠血清中E2蛋白IgG抗體效價Fig.9 IgG titres of sera from the immunized mice

3 討論

WEEV是一類具有囊膜RNA病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬成員，其致病性較強(qiáng)［11，12］。

自發(fā)現(xiàn)WEEV以來，已有80多年歷史，在此期間，人們對WEEV做了大量研究，取得了很多重要科研成果，包括WEEV地理位置分布、傳播途徑、病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)及病毒增殖過程等［13-16］，這對與人類深入認(rèn)識和了解WEEV病毒生物學(xué)特性和致病機(jī)理及其制定預(yù)防該病毒策略具有重要意義。目前，人類尚未完全認(rèn)識和掌握WEEV，尚存很多需要人類花費(fèi)更長時間急需解決的重大問題，包括WEEV如何通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，進(jìn)入之后又是怎樣破壞腦組織引起腦炎，在此過程中，為何小膠質(zhì)細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞和免疫分子不能清除WEEV，WEEV與它們之間發(fā)生了怎樣相互作用。這些問題能否被解決直接關(guān)系到將來WEEV有效預(yù)防與治療。因WEEV傳染性強(qiáng)，致死率高且為人獸共患，一直受到國際社會的高度重視。

近些年，WEEV傳統(tǒng)疫苗研究較多，新型疫苗研究較少，尚需新型高效WEEV疫苗研制。Pedersen等人制成WEEV的弱毒苗、Wu等人［17］用腺病毒 Ad5-WEEV(含有E3-E2-6K-E1結(jié)構(gòu)蛋白)構(gòu)建成核酸疫苗和 Atasheva等人［4］用 Sindbis virus(SINV)/WEEV制成嵌合疫苗都具有很好免疫原性，但它們存在各自缺點(diǎn)，應(yīng)用受限，所以WEEV疫苗研究仍是人類現(xiàn)在面臨一個重要難題，也是有效預(yù)防WEEV關(guān)鍵所在。研究表明VLP與自然病毒體具有相似形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)，能夠有效模擬自然病毒體的抗原表位，尤其是VLP不含核酸，相對更加安全、副作用小，所以預(yù)測VLP將來有望成為最具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦鸵呙纾?8］。因此，本研究對 pcDNA3.1-C-E 載體進(jìn)行了免疫原性研究。結(jié)果表明該重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后，可在細(xì)胞中表達(dá)成病毒樣粒子(VLP)。動物實(shí)驗(yàn)表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-C-E作為核酸疫苗能改變小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞正常比例，能有效活化CD4+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞能夠促進(jìn)B細(xì)胞活化，加上免疫鼠血清中產(chǎn)生WEEV抗體，說明重組質(zhì)粒能夠刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫;另外，免疫小鼠產(chǎn)生高水平 IL-2、IFN-γ 和 IL-4，其中 IL-2、IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，提示重組質(zhì)粒能夠促進(jìn)細(xì)胞免疫活化。由于WEEV屬于高危病原，對其操作要求實(shí)驗(yàn)環(huán)境較高，所以本研究沒有進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)來確定重組質(zhì)粒對WEEV保護(hù)效果。盡管如此，研究結(jié)果初步說明重組質(zhì)粒作為核酸疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性，為今后WEEV新型疫苗研究提供了重要參考。

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