蘇云金芽胞桿菌還原Cr(VI)的轉(zhuǎn)座子突變體庫構(gòu)建和分析＊

黃天培，張 君，蘇新華，關(guān) 雄

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室，福建福州 350002)

金屬污染物廣泛存在于環(huán)境之中，其中鉻是主要的金屬污染物之一［1，2］。尋求高效環(huán)保的含鉻廢水處理方案成為迫切需要解決的問題之一。廢水中的鉻存在形式主要有Cr(III)和Cr(VI)兩種，其中，以Cr(VI)的毒性最大，約是 Cr(III)的1000倍［3］。把Cr(VI)還原成Cr(III)是工業(yè)上處理含鉻廢水最常用的方法之一［4］。其中，微生物法處理含鉻廢水具有投資小、運行費用低、無二次污染等優(yōu)點［5］。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對Cr(VI)具有較強解毒能力的微生物主要有假單胞菌(Pseudmonadaceae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)和硫酸鹽還原菌(Sulfate-reducing bacteria)等［6-7］。微生物可以通過直接還原Cr(VI)、生成代謝產(chǎn)物來處理Cr(VI)和微生物吸附等方式達到解毒Cr(VI)的目的［8-12］。但是，微生物還原Cr(VI)在實際操作中仍然存在很多問題，如已報道能還原Cr(VI)微生物往往在造福人類的過程中對人類的健康產(chǎn)生威脅［13］。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是應(yīng)用廣泛的一種微生物農(nóng)藥，對環(huán)境安全、對人無致病性［13-14］。2005年 Sahin等人研究了 Bt對 Cr(VI)的動力學(xué)吸附過程［11］。2010年，本實驗室研究了不同來源(水樣、土壤、植物、動物、食品、昆蟲和飼料)Bt菌株還原鉻(VI)的情況，證明Bt菌株普遍具有將鉻(VI)還原為鉻(III)的能力，從中篩選出具有較強還原鉻(VI)能力的 Bt菌株［13］。因此，Bt是治理Cr(VI)污染的安全、高效候選材料之一。有鑒于此，以全基因組測序菌Bt 407為研究載體，將轉(zhuǎn)座子隨機突變載體pIC333轉(zhuǎn)化Bt 407，構(gòu)建轉(zhuǎn)座子隨機突變體庫，從中篩選出Cr(VI)還原突變株，確定了其中一株突變株的轉(zhuǎn)座子插入位點，并對突變株的作用機理進行了初步探討，確認了突變株主要通過增強還原能力來提高解毒Cr(VI)能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 Bt菌株407(法國農(nóng)科院Didier Lereclus教授實驗室惠贈)和大腸桿菌TG1(商業(yè)化菌株，本室保存)。

1.1.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉 10 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0 ～7.2。

1.1.3 主要試劑 90 mg/L壯觀霉素水溶液、5 mg/mL紅霉素水溶液、4 mol/L氫氧化鈉、10000 mg/L Cr(VI)、1∶1 硫酸溶液、1∶1 磷酸溶液、2 mg/mL二苯碳酰二肼。

1.2 方法

1.2.1 Bt 407電擊感受態(tài)細胞的制備 參考Lecadet等人方法制備Bt 407電擊感受態(tài)細胞［15］。

1.2.2 轉(zhuǎn)座子隨機突變載體pIC333轉(zhuǎn)化Bt 407參考Lecadet等人方法電擊轉(zhuǎn)化pIC333(法國農(nóng)科院Didier Lereclus教授實驗室惠贈)至Bt 407［15］。參考孫長坡方法利用菌落PCR驗證轉(zhuǎn)化子:以M1(5'-GCATTAATGAATCGGCCAACG-3')和M2(5'-GTGGGTAAACCGTGAATATCG-3')為引物擴增mini-Tn10轉(zhuǎn)座子壯觀霉素抗性基因;以ermF(5'-ATGAACGAGAAAAATATAAAACAC-3')和ermR(5'-TTACTTATTAAATAATTTATAGCTATT-3')為引物擴增pIC333載體上的紅霉素抗性基因［16］。

1.2.3 Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機插入突變體庫的構(gòu)建

參考孫長坡和Kamoun等人方法構(gòu)建Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機插入突變體庫［16-17］。

1.2.4 Cr(VI)還原能力具有顯著差異的突變株篩選 通過Cr(VI)的測定檢測菌株對鉻的還原能力。以1%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接于Cr(VI)濃度為50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，以野生菌株Bt 407為對照，30℃培養(yǎng)24 h后測量菌液中剩余Cr(VI)的溶度。六價鉻的測定采用二苯碳酰二肼分光光度法［18］。

所有的實驗重復(fù)三次，在Excel中求標準差與方差。實驗結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)分析，計算SEM和LSD。

1.2.5 轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼序列的分析 參考QIAGEN公司Gentra Purgene Yeast/Bact.Kit試劑盒進行突變體的總DNA提取。利用Hind III完全酶切突變體總DNA。將酶切產(chǎn)物5μL純化后取5μL加入5μL Kit Ligation Mix，于 PCR 儀中16 ℃ 自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞TG1。利用引物e1(5'-CGTTGGCCGATTCATTAATGC-3')和 e3(5'-CGATATTCACGGTTTACCCAC-3')進行mini-Tn10側(cè)翼序列的擴增，并測序。通過BLAST分析序列同源性，確定轉(zhuǎn)座子插入位點。

1.2.6 Bt 407及其突變子的表型分析

1.2.6.1 生長曲線測定 將Bt 407及其14株突變子的甘油菌活化過夜，1%接種至100mL的LB中，30℃ 230 r/min震蕩培養(yǎng)，每隔1 h測定OD600，直至12 h。

1.2.6.2 Bt 407及其突變子對反應(yīng)液總鉻濃度的影響 以1%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接于Cr(VI)濃度為50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，以野生菌株Bt 407為對照，30℃培養(yǎng)24 h后測量反應(yīng)液中總鉻溶度?？傘t濃度采用高錳酸鉀高溫氧化及二苯碳酰二肼分光光度法于540 nm波長處測定［18-19］。所有的實驗重復(fù)三次，在Excel中求標準差與方差。實驗結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)分析，計算SEM和LSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體庫的構(gòu)建

利用含有mini-Tn10轉(zhuǎn)座子的突變載體pIC333，構(gòu)建了Bt 407 Cry-隨機插入突變體庫，獲得了容量為1500個克隆的突變體庫，并通過抗性檢測和PCR分析對該庫進行了鑒定。

2.1.1 抗性鑒定

構(gòu)建并優(yōu)化轉(zhuǎn)座子隨機突變技術(shù)平臺，將經(jīng)過高溫誘導(dǎo)突變的菌液涂布含有壯觀霉素和紅霉素LB平板，然后置于40℃培養(yǎng)。從該平板上挑取單克隆分別復(fù)制在相互對應(yīng)位置的壯觀霉素抗性平板和紅霉素抗性平板上，然后40℃培養(yǎng)，從抗性上鑒定突變株。其中不能在紅霉素平板上生長(圖1A)但能在壯觀霉素平板生長(圖1B)的克隆即有可能為突變株。

2.1.2 PCR 鑒定

隨機挑取數(shù)個突變子，以M1和M2為引物擴增壯觀霉素抗性基因，以ermF和ermR為引物擴增紅霉素抗性基因。含有載體pIC333的Bt 407轉(zhuǎn)化子可以擴增到mini-Tn10轉(zhuǎn)座子和紅霉素抗性基因，而突變株可以擴增到壯觀霉素，但擴增不到紅霉素抗性基因(圖2)，從而構(gòu)建了一個容量為1500的Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機突變體庫。

圖1 Bt 407突變體庫抗生素抗性檢驗Fig.1 Assay of Bt 407 mutant library by antibiotics

2.2 具有顯著Cr(VI)還原能力差異的突變株的篩選

在Bt 407轉(zhuǎn)座子隨機突變體庫中篩選具有Cr(VI)還原能力具有顯著差異的突變株，利用國家標準的六價鉻的測定(二苯碳酰二肼分光光度法)測定這些突變株還原50 mg/L Cr(VI)24 h后剩余的Cr(VI)濃度，重復(fù)三次，通過方差分析從中篩選出Cr(VI)還原能力與Bt 407野生株相比具有極顯著差異(P＜0.01)的突變株，共獲得14株(圖3)。野生株Bt 407在接種量為1%、溫度為30℃、Cr(VI)初始濃度為50 mg/L的條件下培養(yǎng)24 h后，將Cr(VI)的濃度降解至約22 mg/L，而這14株突變株在相同條件下可降解至低于2.5 mg/L，還原Cr(VI)的能力提高了9倍左右。

2.3 突變體Bt 407-Cr244轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼序列的克隆和序列分析

Bt 407基因組中含有許多Hind III位點，而mini-Tn10中不含有該位點。提取Bt 407-Cr244總DNA，將其基因組經(jīng)HindIII完全酶切為不同大小的片段(圖4A)。將酶切產(chǎn)物純化、自連、轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。提取大腸桿菌TG1轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，并以e1/e3為引物擴增得到mini-Tn10轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列DNA片段，大小約為 2 kb(圖 4B)，說明 Bt 407-Cr244經(jīng)HindIII完全酶切后的自連產(chǎn)物已成功導(dǎo)入大腸桿菌TG1。以 e1/e3為引物，獲得 Bt 407-Cr244的 mini-Tn10側(cè)翼片段的核苷酸序列。對其進行BLAST同源性比較，得出mini-Tn10轉(zhuǎn)座子插入位點與細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ的核苷酸序列高度同源(圖5)。

圖2 Bt 407突變體庫PCR驗證Fig.2 Identification of Bt 407mutant strains by PCR

2.4 Bt 407及其突變子的表型分析

通過測定Bt 407及其突變子的生長曲線以及Cr(VI)還原過程中總鉻濃度來驗證14株突變株能力提高的可能原因。結(jié)果表明，Bt 407及其14株突變子的生長曲線十分相近，排除了菌株繁殖能力提高的原因(圖6)。在培養(yǎng)24小時后，Bt 407-Cr149和Bt 407-Cr285培養(yǎng)液中的總絡(luò)濃度比Bt 407極顯著降低(P＜0.01)，說明 Bt 407-Cr149和 Bt 407-Cr285在解毒Cr(VI)過程中除了還原作用，可能還具有生物吸附(圖7)。因此，突變株處理Cr(VI)能力提高的作用機理主要是還原能力增強，同時，極少數(shù)突變株的生物吸附作用得到加強。

圖3 具有顯著Cr(VI)還原能力差異的Bt 407突變株篩選Fig.3 Bt 407 mutants which Cr(VI)-reduction capacity were significantly different(P ＜0.01)from Bt 407

3 討論

自從1977年Romanenko等人首次報道脫色桿菌能夠在厭氧的條件下還原Cr(VI)開始［20］，越來越多的學(xué)者開始著手研究Cr(VI)還原菌。目前已發(fā)現(xiàn)多種不同的細菌能夠在好氧或厭氧的條件下將Cr(VI)還原成Cr(III)，包括蒼白桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、假單胞桿菌、脫硫弧菌、海藻希瓦氏菌和成團泛菌等［21-22］。然而，利用細菌處理含鉻廢水仍存在一些缺陷:首先是所采用的細菌存在安全性的問題，菌種自身對人類或動物具有毒性;其次，因?qū)μ幚磉^程中的關(guān)鍵活性因子認識不足，以致在實際應(yīng)用中細菌不能發(fā)揮其全部的還原Cr(VI)的能力［4］。而Bt對人類無致病性，不存在菌種安全性問題，并且可以高效還原Cr(VI)，是治理Cr(VI)污染的理想材料之一［13-14］。

圖4 突變體Bt 407-Cr244轉(zhuǎn)座子插入位點側(cè)翼序列的克隆Fig.4 Cloning flanking sequence of transposon insertion site in Bt 407-Cr244

國內(nèi)外研究主要集中于Cr(VI)還原菌的篩選與鑒定以及治理條件的優(yōu)化，對抗性和還原基因研究也較多。1983年，Lawrence等人從鉻廢水中分離出熒光假單胞菌LB300的質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pLHB1具有與Cr(VI)的抗性相關(guān)的基因［23］。1990年，Cervantes等人證明銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的鉻抗性為 ChrA決定［24］。2002年，Juhnke等人通過pMOL編碼的基因chrB1、chrC和chrI突變，驗證了決定鉻抗性的基因［25］。

圖5 Bt 407-Cr244轉(zhuǎn)座子插入位點分析Fig.5 Transposon insertion site in Bt 407-Cr244

圖6 Bt 407及其突變子的生長曲線Fig.6 Growth curves of Bt 407 and the mutants

目前，對Cr(VI)抗性或還原的調(diào)控基因研究還很少。2008年，Branco等人將Tn5轉(zhuǎn)座子隨機突變載體pSUP5011轉(zhuǎn)化蒼白桿菌5bvl1，鑒定了鉻抗性基因的轉(zhuǎn)座位點(TnOtChr)，驗證了其中的 chrB、chrA、chrC和chrF基因的功能，展示了一個關(guān)于鉻抗性操縱子的遺傳系統(tǒng)［26］。2009年，Henne等發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌FB24的基因組中包含著Cr(VI)抗性的決定因子(CRD)，由8個基因組成，包括抗性基因chrA和chrB。研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌Cr(VI)的抗性主要取決于ChrA轉(zhuǎn)運蛋白，新的基因在Cr(VI)的抗性中具有重要作用［27］。轉(zhuǎn)座子隨機插入突變技術(shù)作為轉(zhuǎn)座子組學(xué)研究的一個重要手段，既可以研究已知基因的新功能，也可以用來釣取調(diào)控特定性狀的新基因，是十分成熟的技術(shù)［28］。利用該技術(shù)得到還原Cr(VI)能力顯著提高的Bt 407突變株，并得到一個可能與調(diào)控Cr(VI)還原的基因為細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ。細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ是細胞色素氧化酶復(fù)合體組成單位之一，作為分子標記在真核生物中廣泛應(yīng)用［29-30］。細胞色素氧化酶是線粒體和好氧性細菌的呼吸鏈終端酶，催化電子從細胞色素c分子氧的轉(zhuǎn)移，使分子氧被還原生成水，而電子被耦合到質(zhì)子轉(zhuǎn)運過程中，穿過細胞膜，最后被F0F1-ATP酶利用來合成 ATP［31］，其對 Bt還原 Cr(VI)的影響機制至今未知。此外，通過對Bt 407及其突變子部分表型的研究進一步確認了突變株主要通過增強還原能力來提高解毒Cr(VI)能力。

圖7 在Bt 407及其突變子還原Cr(VI)過程中總鉻的測定Fig.7 Determination of total chromium during the process of Cr(VI)reduction with Bt 407 and its mutants

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