檸檬酸亞錫二鈉對雙孢菇罐頭的護色作用

張婷婷， 夏文水， 姜啟興， 許艷順

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

雙孢菇（Agaricus bisporus）屬草腐菌，中低溫性菇類，含有豐富的蛋白和多糖具一定的抗癌活性，有抑制腫瘤、降低血壓作用。我國稻草、麥草豐富，氣候適合雙孢菇生長，總產占世界第二位，主要加工產品為罐頭，是中國果蔬加工的主導和傳統(tǒng)出口產品，在國際貿易量中占首位，但雙孢菇在加工過程中易變色，雙孢菇的褐變主要是酶促褐變，酚類物質如鄰苯二酚在多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，簡稱PPO）作用下發(fā)生酶促褐變形成醌類化合物，醌自身呈淺褐色，但醌類物質通過非酶聚合反應成為較高相對分子質量的暗褐色化合物；另有非酶褐變如還原性物質與多糖發(fā)生美拉德反應等[1-3]。

國內外已有對抑制酶促褐變的相關研究，Nerya研究發(fā)現(xiàn)二苯基磷酸（DPP）能滲入細胞組織而抑制少量PPO活力防止鮮切蘑菇褐變，但護色效果不佳且DPP在蘑菇組織內不穩(wěn)定，易代謝分解[4]；抗壞血酸及其衍生物能抑制鮮切哈密瓜PPO酶活，但其自身易氧化而引起色變[5-6]；半胱氨酸不能抑制PPO酶活，但能與蘋果酶促反應產物-醌類物質結合成無色硫化物從而抑制褐變[7]；Yue-Xiu Si研究發(fā)現(xiàn)橙皮素可通過降低PPO疏水性而抑制其活性[8]；Yueming Jiang研究發(fā)現(xiàn)用谷胱甘肽和檸檬酸能抑制荔枝PPO活性[9]。中國雙孢菇罐頭生產中普遍采用焦亞硫酸鈉護色，雖控制褐變效果顯著，但由于SO2殘留有害于人體健康，所以國外禁止用于罐頭生產[10]。所以需要找到一種新型的雙孢菇罐頭安全高效護色劑應，抑制褐變反應發(fā)生。

檸檬酸亞錫二鈉（Disodium Stannous Citrate，簡稱DSC），具強還原性，在罐中逐漸消耗殘余氧氣，阻斷食品由于空氣氧化作用而引起的氧化腐敗，延緩食品的氧化所引起的不利變化從而起到抗氧護色作用，保持食品的色澤和風味。金椗梁等研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸亞錫二鈉對鮮切藕產品低溫保藏期間的褐變和PPO活力有明顯抑制作用，可作為亞硫酸鹽的一種替代物應用于鮮切蓮藕產品中[11]。

作者以檸檬酸亞錫二鈉作為護色劑，研究DSC處理對雙孢菇罐頭產品褐變及PPO活性的影響，并與常用護色劑進行比較和復合優(yōu)化，旨在探索新型的安全高效護色劑代替亞硫酸鹽及類似產品的非硫護色方法。

1 材料與方法

1.1 原料與設備

新鮮雙孢菇：購于無錫市雪浪農貿市場，菌柄完整，菌蓋直徑3～4 cm，成熟未開傘；

檸檬酸亞錫二鈉：西隴化工廠股份有限公司產品；焦亞硫酸鈉、檸檬酸、植酸、CaCl2、VC均為分析純；數型恒溫水浴鍋：HH-2，國華電氣有限公司產品；紫外分光光度計：UV2100，尤尼柯（上海）儀器有限公司產品；高速冷凍離心機：4K15，SIGMA公司產品；高速組織搗碎機：DS-1，上海標本模型制造廠產品；色差儀：Ultra Scan PRO，上海信聯(lián)創(chuàng)體電子有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙孢菇罐頭工藝流程 參照Zhimin Li[13-14]等的試驗方法并略有修改，工藝流程如下：

選樣→修剪→稱重→清洗→切片→護色處理→預煮→冷卻→瀝干→挑選修整→裝罐加湯→殺菌冷卻→室溫貯藏

1.2.2 DSC與常用護色劑對雙孢菇切片預處理護色效果比較 選取無腐爛變質的新鮮雙孢菇，洗去泥土，去根，剔除損傷、褐變的雙孢菇，切分為0.5 cm左右的薄片，分別置于如表1所示不同質量分數的DSC、焦亞硫酸鈉、檸檬酸、植酸、VC及NaCl護色溶液中在常溫條件下處理15 min，取出瀝干，測定多酚氧化酶活力（PPO）和褐變度（BD）。

1.2.3 雙孢菇切片預處理復合護色劑各組分最佳配比的確定 在滿足 《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》（GB 2760-2011）用量規(guī)定的前提下，以防止雙孢菇切片酶促褐變?yōu)槟康?，?.2.1單因素試驗的基礎上，采用正交實驗方法正交試驗如表2所示。以DSC、檸檬酸、植酸和VC為因素配制成復合護色液進行如表2所示L9（34）表正交實驗，確定復合護色劑中個護色劑用量。分別以去離子水為空白參照CK1，以0.02%NaHSO3的護色液為對照組 CK2。護色后測定雙孢菇褐變度BD和PPO殘余酶活。

表1 雙孢菇切片預處理護色劑的種類及質量分數篩選表Table 1 Arrange test of single factor of anti-browning agents for fresh -cut Agaricus bisporus pretreatment%

表2 鮮切雙孢菇護色液因素水平表Table 2 Orthogonal design of anti-browning agents for fresh-cut Agaricus bisporus pretreatment

1.2.4 DSC與常用護色劑對雙孢菇罐頭護色效果比較 經1.2.2實驗結果得出的最佳正交復合護色劑預處理過的菇片再經質量分數0.2%檸檬酸溶液預煮9 min后冷卻、裝罐，按表3所示配制成護色液湯汁制成雙孢菇罐頭，以空白（去離子水）為對照組。新鮮雙孢菇制成罐頭樣品貯藏于室溫（25℃）和自然光照條件下6個月，每隔一個月測定多酚氧化酶活力（PPO）和褐變度（BD）。

表3 罐頭護色劑的種類及質量分數篩選表Table 3 Arrange test of single factor of anti-browning agents for canned Agaricus bisporus%

1.2.5 雙孢菇罐頭的復合護色劑各組分最佳配比的確定 參照Zhimin Li[12]等的試驗方法，在含有質量分數0.30% 檸檬酸的護色液中，以DSC、植酸和氯化鈣為三因素配制成復合護色湯汁進行L9（34）表正交實驗制備罐頭，以質量分數0.30%檸檬酸的護色液所得樣品為空白參照CK3，0.02%NaHSO3的護色液所得樣品為空白參照CK4。新鮮雙孢菇制成罐頭樣品貯藏于室溫（25℃）和自然光照條件下6個月，每隔一個月測定多酚氧化酶活力（PPO）和褐變度（BD）。

表4 罐頭護色劑的種類及質量分數篩選表Table 4 Orthogonal design of anti-browning agents for canned Agaricus bisporus

1.2.6 褐變度的測定 參照Mohapatra D，Gemma Oms-Oliu[13-14]的方法，將處理好的雙孢菇切片表面的水分用紙巾吸干，直接用色差儀測定。L*（亮度），a*（紅-綠）和b*（黃-藍）參數值通過反射測量。每組樣品至少進行6次重復測定，取ΔE*平均值為褐變度BD。

1.2.7 多酚氧化酶活力的測定 粗酶液的提?。簠⒄誇atih Kalyoncu、潘永貴等[15-16]方法，稱取20 g樣品，與80 mL預先冷凍至-26℃的丙酮一起倒入組織搗碎機中勻漿（20 000 r/min，2 min），迅速抽濾，保留濾紙上的沉淀部分，將沉淀薄層中的殘留的丙酮用冷風吹去，至沉淀無丙酮味，將所得丙酮粉轉移至 40 mL 0.1 mol/L PBS（pH 6.5）中攪拌 30 min，離心（4 ℃，10 000 r/min，20 min）。 所得上清液即為PPO粗酶液。

測定方法：在410 nm下測定粗酶液的紫外吸收分光光度值A410nm，比色皿中加入0.1 mol/L PBS 1.5 mL，0.1 mol/L鄰苯二酚 1 mL，PPO粗酶液 0.5 mL，混勻后立即用410 nm比色，粗酶液加入后開始計時，每10秒記錄一次A值隨時間變化而變大，以吸光值為縱坐標，反應時間為橫坐標，作吸光值-時間曲線，從最初直線線段斜率（ΔA/Δt）計算多酚氧化酶的活力（參比以緩沖液代替酶液）。酶活定義為：在測定條件下，每min引起吸光度變化0.01所需酶量。每組實驗進行3次重復測定，取3次平均值。

2 結果與討論

2.1 DSC對鮮切雙孢菇的護色效果研究

2.1.1 DSC與不同護色劑對雙孢菇切片預處理護色效果的影響 DSC與常用護色劑的護色效果比較見圖1，由此可知，DSC與常用護色劑均能起到良好的護色作用，而且隨著護色劑質量分數增大，鮮切雙孢菇的PPO活力和褐變度的抑制效果逐漸增強，但增長速率漸趨平緩；各抑制劑護色效果依次為：焦亞硫酸鈉＞DSC＞植酸＞檸檬酸＞VC＞氯化鈉＞空白，盡管焦亞硫酸鈉、DSC和植酸的質量分數較低，但其抑制效果均優(yōu)于較高質量分數的VC、檸檬酸及氯化鈉，其中質量分數0.02%～0.03%DSC的護色效果可與焦亞硫酸鈉媲美，但經后者處理過的雙孢菇切片過于蒼白，失去了原本的灰白色質感。金椗梁研究發(fā)現(xiàn)，在pH 3～6條件下用DSC浸泡處理后的鮮切藕產品可保持較低的褐變度和多酚氧化酶活力[11]；植酸不僅能降低溶液pH值，還可與多種多價金屬絡合，從而抑制多價金屬對PPO酶促反應的催化作用，由此起到護色作用[17]，B Dave、Lixiang Liu等研究發(fā)現(xiàn)其在加拿大大豆、苦丁茶等果蔬制品中取得了較為理想的護色效果[18-19]。

圖1 常溫光照條件下不同質量分數護色劑對雙孢菇切片的護色效果比較Fig.1 Comparison analysis of browning inhibition effect of DSC and other anti-browning agents on freshcut Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

2.1.2 雙孢菇切片預處理正交實驗結果分析 從實驗結果可以看出，與2.1.1結果相比較，正交組復合護色劑對PPO活性抑制及防褐變的效果明顯優(yōu)于單一護色劑溶液，表明不同護色劑之間有一定的協(xié)同作用。根據表5正交分析結果可以得出，各因素對褐變度BD和PPO殘余酶活的影響程度均依次為：DSC＞檸檬酸＞植酸 ＞VC，這與單因素試驗結果相同。復合護色劑的最優(yōu)參數組合為 （質量分數）：檸檬酸 0.2%，DSC 0.03%，植酸 0.02%，VC 0.03%，在最優(yōu)護色處理下，菇片色澤呈現(xiàn)雙孢菇特有的灰白色，形態(tài)正常，護色液清澈透明。

表5 雙孢菇褐變抑制正交實驗L9（34）結果Table 5 Result of orthogonal design for fresh-cut Agaricus bisporus pretreatment

2.2 DSC對雙孢菇罐頭的護色效果研究

2.2.1 DSC與不同護色劑對雙孢菇罐頭護色效果的比較 罐頭湯汁的正交復配設計方案及實驗結果如表2所示。由于雙孢菇罐頭在開罐期間PPO活性抑制率均在99.97%以上，故后期以褐變度BD作為主要參考因素。

圖2 常溫光照條件下各種護色劑對雙孢菇罐頭的護色效果比較Fig.2 Comparison analysis of anti-browning agents on canned Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

不同護色劑對雙孢菇罐頭護色效果的影響結果如圖2所示，數據結果為各護色劑的最大濃度實驗組產品褐變度平均值。由圖可知，焦亞硫酸鈉和DSC防褐變效果最好，其次是植酸、檸檬酸和氯化鈣，VC效果最差，褐變度與空白對照組相近，該組產品湯汁暗黃，菇片也呈現(xiàn)較深的黃褐色，這可能是由于VC雖有一定還原性[20]，但因其本身在高溫殺菌過程中受熱見光易發(fā)生自身氧化而褐變，從而導致色澤的變化，這與O.Lamikanra等[5-6]的研究結果相似。氯化鈣的護色作用是通過保持細胞膜結構的完整性和穩(wěn)定性，阻止底物與酶PPO的接觸，延緩褐變的發(fā)生，同時對果肉具有明顯的護脆效果[19-21]。焦亞硫酸鈉組的湯汁和菇片均顯黃色，且有蒼白的感覺，失去了蘑菇本身的色澤，缺少真實感。故以DSC效果最佳。

2.2.2 雙孢菇罐頭正交實驗結果分析 從表6雙孢菇罐頭正交試驗結果可以看出，各因素對褐變度BD的影響程度均依次為：DSC>植酸>氯化鈣，其中DSC和植酸對雙孢菇罐頭防褐變效果均有顯著性影響；罐頭護色湯汁的復合護色劑的最優(yōu)參數組合為：DSC 0.03%+植酸0.02%+氯化鈣0.30%。金椗梁研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸亞錫二鈉可能具有較強還原性，可通過消耗罐中殘余的氧氣將Sn2+氧化成Sn4+來達到抗氧化目的，而在罐頭中，檸檬酸和植酸可能對其的抗氧化性有一定增效作用[11，22]。

表6 罐頭湯汁L9（34）配方試驗結果Table 6 Result of orthogonal design for canned Agaricus bisporus

圖3表示了分別以復合護色劑、檸檬酸亞錫二鈉、焦亞硫酸鈉及去離子水空白為湯汁護色液對常溫光照條件下6個月保存期內的雙孢菇罐頭的護色效果比較，數據結果為各實驗組產品褐變度平均值。由圖可知，與空白組相比較，經護色液處理過的產品的褐變程度均得到了有效抑制，在雙孢菇罐頭的6個月保藏期內，正交復合護色劑取得了最佳的護色效果，而檸檬酸亞錫二鈉的褐變抑制效果與亞硫酸鈉相當。

3 結語

圖3 常溫光照條件下復合護色劑與其他護色劑對雙孢菇罐頭的護色效果比較Fig.3 Comparison analysis of compound color fixative and otheranti-browningagentson canned Agaricus bisporus at room temperature（25℃）in natural light condition

1）與常用護色劑相比，DSC對雙孢菇PPO活力和褐變度有明顯的抑制作用，護色效果優(yōu)于檸檬酸、植酸和氯化鈣，而與焦亞硫酸鈉效果相當；預煮前經質量分數 0.2%檸檬酸，0.03%DSC，0.02%植酸，0.03%VC復合護色劑浸泡處理15 min后的雙孢菇可保持較低的褐變度和PPO活力，表明在預處理階段，DSC對雙孢菇切片酶促褐變的抑制作用是非常顯著的；

2）DSC在雙孢菇罐頭中也有理想的褐變抑制效果，且DSC的復合護色劑湯汁質量分數0.03%DSC，0.02% 植酸，0.30% 氯化鈣對雙孢菇罐頭在室溫自然光照保藏期間質量分數均有非常顯著的護色效果，可與0.02%焦亞硫酸鈉媲美，各因素對其影響程度為：DSC>植酸>氯化鈣。DSC可作為雙孢菇罐頭中替代焦亞硫酸鈉的新型安全高效護色劑。

綜上，雙孢菇罐頭的最佳工藝條件為：質量分數 0.2%檸檬酸，0.03%DSC，0.02%植酸，0.03%VC復合護色劑浸泡預處理15 min；再經0.2%檸檬酸溶液預煮9 min后冷卻、裝罐，按復合護色劑湯汁0.03%DSC，0.02%植酸，0.30%氯化鈣制成雙孢菇罐頭，在室溫（25℃）自然光照下保存，取得較好的褐變抑制效果。

迄今為止，國內外關于檸檬酸亞錫二鈉對雙孢菇的褐變抑制機理的研究較少，尚無明確清晰的原理分析，作者僅是應用DSC進行雙孢菇罐頭的初步試驗，具體的作用機理還需進一步的研究。

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