BNP在不同緩沖體系中的血管舒張功能評(píng)價(jià)

高 昊， 劉利平， 馬 鑫， 陳 蘊(yùn)， 金 堅(jiān)

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

BNP作為心臟分泌的利尿鈉肽家族的一員，起初是從豬腦中被提取純化的[1]。內(nèi)源性人BNP是一種主要由心室肌分泌的循環(huán)多肽，其分泌水平與心室內(nèi)容量和壓力負(fù)荷狀態(tài)相關(guān)[2]。心臟在功能受損時(shí)分泌BNP，起到對(duì)抗性調(diào)節(jié)激素作用，即通過(guò)與RAAS內(nèi)皮質(zhì)素-1和SNS等生理性拮抗和抑制作用來(lái)維持心功能與體液平衡[3]。隨著心臟功能的進(jìn)一步惡化，血管神經(jīng)激素系統(tǒng)和保鈉潴水激素系統(tǒng)的過(guò)度激活，機(jī)體陷入循環(huán)系統(tǒng)病理生理紊亂，最終掩蓋了內(nèi)源性BNP心臟保護(hù)的代償作用[4]。適時(shí)給予外源性BNP，使其血漿濃度增加2～6倍，可迅速改善急性失代償患者血流動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)激素水平和臨床體征，降低患者的死亡率[5]。

重組人腦鈉肽 （recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP）注射液已先后被美國(guó)FDA和中國(guó)SFDA批準(zhǔn)上市，用于急性失代償性心衰的治療，其臨床治療方式為靜注，療程在2周以上。經(jīng)過(guò)10余年的臨床應(yīng)用，The Connor Group等機(jī)構(gòu)通過(guò)歐美多個(gè)醫(yī)學(xué)中心的6 000多個(gè)治療病例，分析發(fā)現(xiàn)FDA批準(zhǔn)上市的奈西立肽（重組人腦鈉肽商品名）治療心衰患者后，其死亡率和再住院率沒(méi)有明顯的改善，卻與患者中低血壓病例的數(shù)量增長(zhǎng)有直接的聯(lián)系，因此Connor等機(jī)構(gòu)不推薦奈西立肽作為心衰病人的一線治療藥物[6]。在國(guó)內(nèi)，作者在與一些心血管醫(yī)師的溝通中也獲得該類(lèi)藥物存在療效不穩(wěn)定的缺陷。從FDA公布的資料來(lái)看，BNP類(lèi)藥物是一類(lèi)有效的血管擴(kuò)張劑，但利尿作用不明顯，且成藥性研究也與臨床應(yīng)用結(jié)果差距頗大。作者推測(cè)其問(wèn)題可能主要存在兩個(gè)方面：第一，rhBNP因原核表達(dá)除了產(chǎn)物完整性的因素外，缺乏對(duì)其有效二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行必要的構(gòu)象限定；第二，生產(chǎn)廠家在制劑制備過(guò)程中未對(duì)rhBNP進(jìn)行系統(tǒng)的微環(huán)境研究，導(dǎo)致高活性rhBNP的二級(jí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。作者以化學(xué)合成獲得的完整BNP為研究對(duì)象，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的緩沖體系來(lái)提高和穩(wěn)定BNP的活性，為開(kāi)展更有效的BNP注射劑配方研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BNP （氨基酸序列：SPKMVQGSGCFGRKMDRI SSSSGLGCKVLRRH），由上海生工生物工程有限公司合成，純度＞99%，未對(duì)其第10位和26位的Cys進(jìn)行氧化形成鏈內(nèi)二硫鍵。新活素（凍干重組人腦利鈉肽），為成都諾迪康生物制藥有限公司產(chǎn)品（國(guó)藥準(zhǔn)字S20050033），其注射劑組成為0.5 mg重組人腦利鈉肽、8 mg 甘露醇、1.73 mg Na2HPO4、0.93 mg NaH2PO4、9 mg NaCl。去氧腎上腺素，系阿拉丁產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Krebs溶液的配制：NaCl 9.0 g、 KCl 0.42 g、CaCL20.24 g、NaHCO30.1～0.3 g、 葡萄糖 1.0～2.5 g（1 000 mL），葡萄糖在使用前加入。

新西蘭家兔，體質(zhì)量2～2.5 kg，雌雄不限，由江蘇省血吸蟲(chóng)防治研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 離體血管的灌流實(shí)驗(yàn) 家兔耳緣靜脈空氣推注處死后，取其胸主動(dòng)脈，在預(yù)冷的氧飽和Krebs液中分離結(jié)締組織，制成系列3～4 mm長(zhǎng)的血管片段，每個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的血管條數(shù)均為6。將兔胸主動(dòng)脈血管片段于37℃通氧條件下懸吊入含4 mL Krebs溶液的平滑肌浴漕中，接張力換能器到生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（改良型血管、胃腸和子宮等離體灌流實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，medease改良型，南京美易科技有限公司），記錄血管張力的變化。初始張力定位2.5 g，經(jīng)6 μmol/L KCl溶液灌洗和去KCl溶液平衡20 min后，給予6 μmol/L的去氧腎上腺素作為預(yù)刺激。待收縮張力穩(wěn)定后，再給予10-8～10-5mol/L BNP觀察血管片段張力變化。以新活素的純水溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，逐步增加以制成累計(jì)濃度—舒張反應(yīng)曲線，待藥物濃度達(dá)到10-5mol/L時(shí)，停止加藥并記錄舒張反應(yīng)。詳見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

1.2.2 pH梯度緩沖液的配備 考察pH分別為4、5、6、7、8（偏差±0.2），緩沖液體系分別為醋酸/醋酸鈉（醋酸鹽）、磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀（磷酸鹽）和檸檬酸/磷酸氫二鈉 （檸檬酸鹽）3種體系下BNP的活性表現(xiàn)。按表1所列濃度配置母液，然后按表2的比例制備緩沖液。各緩沖液的pH均在其緩沖范圍內(nèi)[8]，如表 3所列。

1.2.3 斑馬魚(yú)體內(nèi)試驗(yàn) 取數(shù)尾斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于六孔板中，加入3 mL魚(yú)水，再加入的特非那定溶液至一定濃度，誘導(dǎo)一定時(shí)間后，移除誘導(dǎo)劑，用魚(yú)水清洗3次，在顯微鏡下挑選靜脈淤血明顯的斑馬魚(yú)進(jìn)行注射。用微量加樣槍頭吸取3 μL待測(cè)藥液，推注入顯微注射針中，將針裝入注射柄中，調(diào)節(jié)壓力和注射時(shí)間使注射量為10 nL。隨后將挑選的斑馬魚(yú)幼魚(yú)置于含160 μg/mL的MS222（間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，魚(yú)用麻醉藥）的魚(yú)水中，麻醉至無(wú)觸碰反應(yīng)后，對(duì)其進(jìn)行靜脈注射，注射結(jié)束后用正常魚(yú)水進(jìn)行清洗，直至復(fù)蘇，放置28℃培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。在給藥后2 h，針對(duì)斑馬魚(yú)的心臟及靜脈淤血部位進(jìn)行照相，觀察淤血有無(wú)消除。

表1 母液的制備Table 1 Preparation of mother solution

表2 緩沖液的制備Table 2 Preparation of buffer

表3 緩沖容量Table 3 Buffer capacity mol/L

2 結(jié)果與討論

2.1 重組BNP醋酸/醋酸鈉緩沖溶液對(duì)離體血管的影響

將藥物對(duì)數(shù)濃度和舒張率的數(shù)據(jù)收集并繪制累計(jì)濃度—舒張反應(yīng)曲線，計(jì)算各個(gè)pH條件下BNP的EC50和95%可信區(qū)間，并與陽(yáng)性藥物做統(tǒng)計(jì)分析。如圖1和表4所示，BNP在pH為4和5的醋酸/醋酸鈉條件下，均對(duì)血管具有顯著的舒張效應(yīng)，且在pH=5醋酸/醋酸鈉緩沖液條件下，BNP舒張兔胸主動(dòng)脈血管片段作用的最適濃度為10-7mol/L。而pH=6的BNP緩沖溶液與陽(yáng)性對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。在實(shí)驗(yàn)觀察的干預(yù)藥物濃度內(nèi)均優(yōu)于pH=6的溶液條件，暗示接近生理pH的醋酸溶液對(duì)BNP活性保持有利。EC50的提高，則說(shuō)明酸性條件下有利于穩(wěn)定BNP的活性。

圖1 BNP的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液與家兔離體血管舒張效應(yīng)的劑量關(guān)系Fig.1 Relationship between BNP in HAc/NaAc buffer concentration and relaxation effects on isolated vascular

表4 醋酸/醋酸鈉緩沖液的EC50及其95%可信區(qū)間Table 4 EC50 and 95%Confidence Intervals of 醋 酸/醋酸鈉buffer

2.2 重組BNP磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖溶液對(duì)離體血管的影響

從圖2和表5可知，在pH為6和7的磷酸鹽緩沖條件下，BNP均能明顯表現(xiàn)出舒張兔胸主動(dòng)脈血管環(huán)的作用；而當(dāng)pH=8時(shí)，BNP則失去活性。與pH=6時(shí)的舒張血管效果不同，pH=7時(shí)舒張血管沒(méi)有劑量依賴關(guān)系，但作用濃度范圍明顯加寬，效果穩(wěn)定性提高。與圖1中的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液相比較，BNP在近中性的生理?xiàng)l件下能保持較高的生物活性是磷酸鹽緩沖條件的顯著優(yōu)勢(shì)。

圖2 BNP的磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀緩沖溶液與家兔離體血管舒張效應(yīng)的劑量關(guān)系Fig.2 Relationship between BNP in K2HPO4/KH2PO4 buffer concentration and relaxation effects oon isolated vascular

表5 磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀緩沖液的EC50及其95%可信區(qū)間Table 5 EC50 and 95%Confidence Intervals of K2HPO4/KH2PO4buffer

2.3 重組BNP檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液對(duì)離體血管的影響

由圖3和表6分析得知，BNP在檸檬酸緩沖條件下活性與劑量依賴關(guān)系更明確。當(dāng)pH為4～6時(shí)，實(shí)驗(yàn)高濃度BNP的檸檬酸緩沖溶液對(duì)兔胸主動(dòng)脈血管片段不僅表現(xiàn)出了更好的舒張效果 （50%vs 100%，50%vs 100%）， 而且在 10-8～10-5mol/L 濃度區(qū)間內(nèi)呈良好的劑量依賴性，因而B(niǎo)NP在這個(gè)條件下會(huì)有更佳的安全性和更高的活性。

圖3 BNP的Citric acid/Na2HPO4緩沖溶液與家兔離體血管舒張效應(yīng)的劑量關(guān)系Fig.3 Relationship between BNP in Citric acid/Na2HPO4 buffer concentration and relaxation effectson isolated vascular

表6 檸檬酸/磷酸二氫鉀緩沖液的EC50及其95%可信區(qū)間Table 6 EC50 and 95%Confidence Intervals of Citric acid/Na2HPO4buffer

2.4 斑馬魚(yú)體內(nèi)試驗(yàn)

雖然離體血管灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行У赜^察到BNP在不同緩沖溶液中的活性，但是體外試驗(yàn)的局限性并不能夠了解BNP對(duì)于心臟的作用，因此隨后委托杭州環(huán)特生物有限公司在斑馬魚(yú)上做體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)BNP在不同緩沖體系的體內(nèi)活性。

2.4.1 給藥前處理 挑選生長(zhǎng)發(fā)育完整的斑馬魚(yú)成體，使用特非那定在斑馬魚(yú)模型上制造心衰淤血模型，如圖4所示斑馬魚(yú)給藥后患有心包水腫，同時(shí)伴有淤血。

圖4 斑馬魚(yú)模型Fig.4 Zebra fish model

2.4.2 給藥注射觀察 分別給斑馬魚(yú)心衰模型注射空白緩沖液和BNP緩沖液，pH值分別為4和5，注射后的心臟形態(tài)如圖5和圖6。根據(jù)圖5和圖6能夠發(fā)現(xiàn)：BNP在pH=4和pH=5的檸檬酸緩沖液體系中對(duì)心臟具有良好的活性和療效。兩者都有效地改善了斑馬魚(yú)的心包水腫癥狀并消除了顯著淤血。并且BNP在pH=4的條件下其消除淤血的能力比pH=5的條件下要強(qiáng)，而這也與家兔離體血管實(shí)驗(yàn)中對(duì)于血管舒張的結(jié)果相吻合。

圖5 pH=4.0的BNP緩沖液對(duì)模型的影響Fig.5 Effect of BNP in pH=4.0 buffer in zebra fish model

圖6 pH=5.0的BNP緩沖液對(duì)模型的影響Fig.6 Effect of BNP in pH=5.0 buffer in zebra fish model

2.5 討論

BNP等多肽藥物的共性需要有效二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象限定才能保持活性[9]，本實(shí)驗(yàn)中雖然不同緩沖條件的BNP溶液在離體兔胸主動(dòng)脈血管片段上都表現(xiàn)出了一定的舒張作用，但差異性很大，更加值得重視的是在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件下，對(duì)照藥物都未獲得有效的結(jié)果，也進(jìn)一步證明微環(huán)境研究對(duì)不穩(wěn)定的多肽藥物二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，偏酸的多數(shù)緩沖條件均利于BNP活性的保持，偏堿則反之。在微偏酸的醋酸/醋酸鈉緩沖液條件下，BNP活性保持的效果明顯，表現(xiàn)為有效濃度下降，但活性保持與劑量關(guān)系復(fù)雜，高劑量頻繁出現(xiàn)舒張不應(yīng)、反而收縮的表象降低了該緩沖體系的適用性。

已上市的BNP藥物采用的磷酸鹽緩沖條件，在近中性的生理?xiàng)l件下可保持較高的BNP生物活性，這是其作為制劑緩沖條件的優(yōu)勢(shì)。雖然BNP的作用穩(wěn)定性在磷酸鹽緩沖條件下得以明顯提高，但舒張血管作用的非劑量依賴關(guān)系，對(duì)于外源給予BNP改善急性失代償性心衰的癥狀不利，是否是Connor等機(jī)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)rhBNP對(duì)治療指數(shù)無(wú)效性的原因之一，尚需進(jìn)一步補(bǔ)充證明。與對(duì)照藥物相比，BNP在微偏酸的檸檬酸溶液中的離體兔胸主動(dòng)脈血管片段舒張率提高了4倍（100%vs 20%），且呈現(xiàn)了良好的藥物劑量依賴效應(yīng)，因此檸檬酸緩沖液作為BNP注射劑的基質(zhì)是確實(shí)可行的。急性失代償性心衰癥狀緩解的治療關(guān)鍵是 “強(qiáng)心、擴(kuò)血管和利尿”[10]，明確檸檬酸緩沖條件下BNP舒張血管的劑量依賴關(guān)系，對(duì)于臨床治療制劑的設(shè)計(jì)有利，pH 5或6的檸檬酸緩沖液具有作為改進(jìn)BNP注射劑處方的潛在價(jià)值。

3 結(jié)語(yǔ)

在相同的緩沖體系條件下，BNP的活性隨pH值而變化，其在酸性環(huán)境下的活性明顯好于中性和堿性條件下的活性，推測(cè)這是因?yàn)锽NP在酸性條件下的結(jié)構(gòu)特征能夠更好地與血管上的作用受體相結(jié)合。雖然在酸性環(huán)境下BNP都表現(xiàn)出了活性，但在同一pH條件下，不同緩沖體系間的活性差異也極其顯著，它表明BNP在特定緩沖體系條件下所形成的構(gòu)象對(duì)于其受體也具有更高的活性。這也意味著一些看似結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的多肽類(lèi)藥物也與大分子蛋白質(zhì)相類(lèi)似，必須有著正確的折疊結(jié)構(gòu)才會(huì)表現(xiàn)出更高的活性和穩(wěn)定性，而這卻是以往實(shí)驗(yàn)中常常被忽略的現(xiàn)象。同時(shí)也意味著在多肽類(lèi)藥物的生產(chǎn)過(guò)程中，重組表達(dá)方法并不能生產(chǎn)出合格的多肽類(lèi)藥物產(chǎn)品，其外在環(huán)境對(duì)多肽活性的影響也是需要考慮的，還提示化學(xué)合成的多肽原料藥需要進(jìn)行優(yōu)化折疊和折疊后構(gòu)象限定的工藝研究。

[1]Potter L R，Yoder A，F(xiàn)lora R，et al.Natriuretic peptides：their structures，receptors，physiologic functions and therapeutic applications[J].Handb Exp Pharmacol，2009，191：341-366.

[2]Alexander G Semenov，Karina R Seferian.Biochemistry of the human B-type natriuretic peptide precursor and molecular aspects of its processing[J].Clinica Chimica Acta，2011，412：850-860.

[3]Mark Oremus，Parminder S Raina.A systematic review of BNP as a predictor of prognosis in persons with coronary artery disease[J].Clinical Biochemistry，2008，41：260-265.

[4]Yunus Emiroglu，Ramazan Kargin.BNP levels in patients with long-term exposure to biomass fuel and its relation to right ventricular function[J].Pulmonary Pharmacology&Therapeutics，2010，23：420-424.

[5]Lee C Y，Burnett J C.Natriuretic peptides and therapeutic applications[J].Heart Fail Rev，2007，12：131-142.

[6]Chen H H，Burnett J C.Clinical application of the natriuretic peptides in heart failure[J].European Heart Journal Supplements，2006（8）：E18-E25.

[7]王躍民，裴建明，朱妙章，等.C型鈉尿肽的擴(kuò)血管作用及機(jī)制[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2001（2）：174-177.WANG Yue-ming，Pei Jian-ming，Zhu Miao-zhang，et al.C-type natriuretic peptides of expanding blood vessel function and mechanism[J].Chinese Journal of Applied physiology，2011（2）：174-177.（in Chinese)

[8]張龍翔.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1997.

[9]徐國(guó)恒.二硫鍵與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[J].生物學(xué)通報(bào)，2010，45（5)：5-6.XU guo-heng.Disulfide bond and protein structure[J].Bulletin of Biology，2010，45（5)：5-6.（in Chinese)

[10]古憶.B型利鈉肽在慢性心力衰竭中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)臨床研究，2011，24（4）：338-339.GU Yi.The application process of B-type natriuretic peptide in chronic heart failure[J].Chinese Journal of Clinical Research，2011，24（4）：338-339.（in Chinese）