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    塞來(lái)昔布聯(lián)合卡培他濱對(duì)H22肝癌移植瘤小鼠的抑制作用及機(jī)制

    2013-11-08 07:03:02姚志華苑亞?wèn)|劉艷艷郭宏強(qiáng)姚書(shū)娜楊樹(shù)軍
    關(guān)鍵詞:抑瘤率塞來(lái)卡培

    姚志華,苑亞?wèn)|,劉艷艷,郭宏強(qiáng),趙 燕,姚書(shū)娜,楊樹(shù)軍

    1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科,鄭州450008

    2武警河南總隊(duì)醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州450052

    肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在全球惡性腫瘤中居第5位,嚴(yán)重危害人類生命健康。研究表明,環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)的過(guò)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),而COX-2抑制劑對(duì)多種腫瘤均有較強(qiáng)的抑制作用,且與其他常規(guī)化療藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用[1]。本研究采用選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布與氟嘧啶類抗腫瘤藥物卡培他濱聯(lián)合用于H22肝癌細(xì)胞移植瘤小鼠,觀察腫瘤抑制作用并探討其作用機(jī)制,以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    材料和方法

    材料人肝癌H22細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(37℃、5%CO2),采用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。BALB/c裸鼠,清潔級(jí),體重 (20±2)g,雌雄各半,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SYXK(豫)2005-0012。塞來(lái)昔布膠囊 (西樂(lè)葆)購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司,卡培他濱 (希羅達(dá))購(gòu)自上海羅氏公司,小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司,DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,兔抗小鼠COX-2、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65 和β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自上??党缮锟萍加邢薰荆琓rizol試劑購(gòu)自美國(guó)Introvigen公司,PCR試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司。

    小鼠皮下移植瘤模型無(wú)菌環(huán)境下,吸取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,無(wú)菌生理鹽水調(diào)整至細(xì)胞濃度為1×107/ml,接種于BALB/c小鼠右前肢腋窩皮下,每只小鼠的接種量為0.2 ml,制備小鼠H22移植瘤模型。

    動(dòng)物分組及給藥40只模型小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、卡培他濱組和聯(lián)合干預(yù)組4組,每組10只。塞來(lái)昔布以100 mg/kg灌胃[2],卡培他濱以755 mg/kg(相當(dāng)于最大耐受量2.1 mmol/kg)灌胃[3],聯(lián)合干預(yù)組同時(shí)給予塞來(lái)昔布和卡培他濱,給藥劑量及途徑與單獨(dú)用藥組相同。對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。從接種后第3天起,每天給藥1次,連續(xù)15 d。

    指標(biāo)檢測(cè)末次給藥24 h后,脫頸處死小鼠,剝離完整腫瘤組織,生理鹽水漂洗干凈,吸水紙吸干水分后于電子天平稱重,記錄腫瘤重量 (瘤重)并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。采用熒光定量PCR和Western blotting分別檢測(cè)瘤組織中NF-κB p65和COX-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平。

    熒光定量PCR取新鮮瘤組織,采用Trizol試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用熒光定量PCR方法檢測(cè) NF-κB p65和 COX-2的 mRNA表達(dá)水平。NF-κB p65 上游引物:5’-ACCCCTTTCAAGTTCCCATAGA-3’,下游引物:5’-ACCTCAATGTCTTCTTTCTGCAC-3’;COX-2 上游引物:5’-GTCTGATGATGTATGCCACAATCTG-3’,下游引物:5’-GATGCCAGTGATAGAGG GTGTTAAA-3’;內(nèi)參 β-actin 上游引物:5’-TGTGCCCATCTACGAGGGGTATGC-3’,下游引物:5’-GGTA CATGGTGGTGCCGCCAGACA-3’。引物由生興生物技術(shù)(南京)有限公司合成。采用 2-ΔΔCT法分析結(jié)果[4]。

    Western blotting取瘤組織約100 mg,加入10倍體積的RIPA組織蛋白裂解液,勻漿機(jī)勻漿后,于12 000×g離心20 min,吸取上清液,棄沉淀。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量??偟鞍?(約50 μg)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉于室溫下封閉2 h,分別加入兔抗小鼠NF-κB p65和COX-2的一抗,按照體積比1∶1000稀釋,4℃孵育過(guò)夜,TBST漂洗3次,每次5 min,加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫下孵育4 h,TBST漂洗3次,每次5 min。采用ECL法顯影并壓片。采用Quantity One v4.62軟件分析條帶灰度值,結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參β-actin的相對(duì)灰度值表示。

    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件,結(jié)果以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    對(duì)抑瘤率的影響塞來(lái)昔布和卡培他濱組的平均瘤重均較對(duì)照組顯著降低 (P<0.01,P<0.001),兩組抑瘤率分別為30.2%和49.9%。聯(lián)合干預(yù)組的抑瘤率高達(dá)75.4%,平均瘤重明顯低于塞來(lái)昔布組和卡培他濱組 (P<0.01,P<0.05)(表1)。

    對(duì)NF-κB和COX-2的mRNA表達(dá)的影響NF-κB p65的mRNA表達(dá)水平在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。塞來(lái)昔布和聯(lián)合干預(yù)組顯著抑制了COX-2的mRNA表達(dá),與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均<0.001),卡培他濱對(duì)COX-2的mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響 (圖1)。

    對(duì)NF-κB p65和COX-2蛋白表達(dá)的影響塞來(lái)昔布組和聯(lián)合干預(yù)組NF-κB和COX-2的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著下降 (P<0.05);卡培他濱亦可減少NF-κB和COX-2的表達(dá),但與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)(圖2)。

    表1 塞來(lái)昔布和卡培他濱對(duì)抑瘤率的影響 (n=10)Table 1 Effects of celecoxib and capecitabine on tumor inhibition rate(n=10)

    圖1 塞來(lái)昔布和卡培他濱對(duì)NF-κB p65和COX-2的mRNA表達(dá)的影響Fig 1 Effects of celecoxib and capecitabine on mRNA expression of NF-κB p65 and COX-2

    圖2 塞來(lái)昔布和卡培他濱對(duì)NF-κB p65和COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effects of celecoxib and capecitabine on protein expression of NF-κB p65 and COX-2

    討 論

    COX-2是催化花生四烯酸合成前列腺素的關(guān)鍵限速酶,眾多研究表明,COX-2在多種癌組織中高度表達(dá)[5],與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。COX-2抑制劑塞來(lái)昔布具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)[6-7],臨床研究顯示,塞來(lái)昔布與5-氟尿嘧啶聯(lián)合用于治療多耐藥性肝細(xì)胞癌可顯著增強(qiáng)抑瘤效果[8],提示塞來(lái)昔布用于聯(lián)合化療具有巨大的應(yīng)用前景??ㄅ嗨麨I是一種新型的抗腫瘤藥物,在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶后發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),臨床常用于治療乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、食管癌等,近來(lái)發(fā)現(xiàn)卡培他濱對(duì)肝癌亦有良好的治療作用[9]。既往研究表明,卡培他濱與塞來(lái)昔布聯(lián)合化療晚期結(jié)直腸癌可有效控制疾病進(jìn)展并減輕不良反應(yīng)[10],但兩藥聯(lián)合用于肝癌則鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,塞來(lái)昔布和卡培他濱兩藥單用均可抑制肝癌H22小鼠瘤組織的生長(zhǎng),抑瘤率分別為30.2%和49.9%,而聯(lián)合干預(yù)組抑瘤率高達(dá)75.4%,療效顯著優(yōu)于單藥治療,提示塞來(lái)昔布和卡培他濱兩藥聯(lián)用治療肝癌H22小鼠具有協(xié)同效應(yīng)。

    NF-κB是COX-2的重要上游調(diào)節(jié)因子,在炎癥、腫瘤等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。多種致癌因子均可通過(guò)上調(diào)NF-κB的表達(dá),刺激細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。生理狀況下,NF-κB是由p65和p50兩個(gè)亞基以及抑制性蛋白IκB結(jié)合為三聚體形式存在,當(dāng)被白細(xì)胞介素-1、內(nèi)毒素等激活后,IκB脫離下來(lái),活化的二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與DNA特定識(shí)別序列結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄,刺激腫瘤細(xì)胞大量增殖,其中p65是起關(guān)鍵作用的催化亞基。抑制NF-κB可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn),塞來(lái)昔布作為COX-2選擇性抑制劑,可抑制人肝癌細(xì)胞 HeG2中 NF-κB和COX-2表達(dá)[11]。本研究結(jié)果表明,塞來(lái)昔布和聯(lián)合干預(yù)組NF-κB p65和COX-2的蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著下降,而卡培他濱組NF-κB p65和COX-2的表達(dá)則無(wú)明顯變化,提示塞來(lái)昔布與卡培他濱具有不同的抗腫瘤機(jī)制,兩藥聯(lián)用可通過(guò)不同的途徑在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮協(xié)同作用。

    綜上,本研究結(jié)果提示,塞來(lái)昔布可通過(guò)抑制NF-κB p65和COX-2的表達(dá),增強(qiáng)卡培他濱的抗腫瘤效應(yīng),兩藥聯(lián)用具有良好的協(xié)同增效作用,為臨床治療肝癌提供了理論依據(jù)。

    [1]劉智豪,劉叔文,余樂(lè).COX-2抑制劑聯(lián)合抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2012,28(12):1651-1654.

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