聚乙烯醇/殼聚糖載藥電紡纖維膜的制備及性能表征

章亞妮，鄔珊維，徐佳瑤，陳 偉，呂媛媛

(浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310015)

靜電紡絲是一種借助于靜電場作用對聚合物溶液或熔體進(jìn)行紡絲的過程，它所形成的纖維直徑為亞微米級。靜電紡絲制成的超細(xì)纖維膜，具有多孔結(jié)構(gòu)，有較高的比表面積，在過濾、納米復(fù)合材料、傷口敷料以及組織工程支架等方面具有許多潛在的用途。靜電紡絲法制備的修復(fù)用無紡納米纖維膜的孔徑通常為50 nm～1μm，可以用來阻擋細(xì)菌和灰塵所致的創(chuàng)傷感染，因此在傷口敷料領(lǐng)域具有廣泛的用途［1-3］。丹參素(Salvianic acid A，SA)是從中國傳統(tǒng)中藥唇形科植物丹參中提取到的一個具有酚性芳香酸類化合物，具有廣泛的藥理作用。近年來愈來愈多的研究表明，丹參素能促進(jìn)創(chuàng)傷組織修復(fù):丹參素對轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血小板活化因子(PAF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)等多種細(xì)胞因子的分泌具有調(diào)節(jié)作用，且能顯著抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的上述因子的大量分泌，具有抗炎和增強(qiáng)免疫這兩方面的調(diào)節(jié)作用;此外，能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性創(chuàng)傷動物感染創(chuàng)面修復(fù)，并可顯著抑制TNF-α、IFN-γ 等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生［4-6］。通過改變給藥途徑，將丹參素作為主藥載入高分子載體材料中，結(jié)合高新材料加工方法制備成現(xiàn)代新型醫(yī)用敷料，不僅賦予丹參素外用于皮膚的新用途，也為中藥劑型開發(fā)開辟了新途徑。

殼聚糖(Chitosan，CS)具有止痛、止血、減小疤痕、良好的生理相容性和生物可降解性等優(yōu)異性能非常適宜于作為傷口敷料的原料［7-10］。但由于它所形成的膜較脆，力學(xué)性能不好，因而常采用與其他生物可降解高分子材料相結(jié)合，經(jīng)高新技術(shù)方法加工制成復(fù)合型敷料。因此，本研究采用生物相容性良好的天然高分子材料殼聚糖(Chitosan，CS)和成纖性好、生物相容性優(yōu)、可生物降解的合成高分子聚合物聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)混合為載體材料，擔(dān)載丹參素鈉(Salvianic acid A sodium，SAS;丹參素在自然界中不穩(wěn)定，故把其做成鈉鹽，功效和丹參素一樣)，通過靜電紡絲制備成載藥醫(yī)用纖維，對纖維的形態(tài)、藥物與纖維載體的結(jié)合狀態(tài)、纖維含藥量以及載藥纖維的釋藥特性進(jìn)行了研究，為以后的臨床應(yīng)用提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 聚乙烯醇(PVA，聚合度1750±50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，殼聚糖(CS，醫(yī)用級，脫乙?；葹?2.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，丹參素鈉(SAS，純度99%，西安鴻生生物技術(shù)有限公司)，紫外可見吸收光譜儀(UV 2450，Shimadzu，日本)，傅立葉紅外光譜儀(Nexus 470，Nicolet，美國)，場發(fā)射掃描電鏡(SIRON-100，F(xiàn)EI，美國)，微量注射泵(WZ-50C2，浙江大學(xué)醫(yī)藥儀器有限公司)，高壓電源(DW-P303-1ACF0，天津東文高壓電源廠)，Millipore 去離子水機(jī)(Milli-Q)。

1.2 方法

1.2.1 載藥電紡纖維膜的制備 將5 g 聚乙烯醇(PVA)顆粒在攪拌情況下緩緩加入到45 ml 超純水中，充分溶脹后升溫至90℃左右加速溶解，并保溫3 h，直到溶液不再含有微小顆粒，制得透明的PVA 溶液。再稱取0.1g 殼聚糖(CS)溶解在10 ml 超純水中，然后滴加3 滴乙酸，直到溶液澄清后滴加到40 ml 的上述PVA溶液中，制得PVA/CS 的前驅(qū)體溶液。分別加入1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、6.0% (為聚合物溶液總質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的丹參素鈉(SAS)，在室溫下充分?jǐn)嚢?，混合均勻后于靜電紡絲儀器上紡絲。紡絲條件如下:電源電壓22 kV，針頭與接收基板之間的距離14 cm，供料速度1.0 ml/h，整個靜電紡絲過程在室溫下進(jìn)行，收集10 h后即可在鋁膜上收集到PVA/CS/SAS 靜電紡絲纖維，于50℃真空干燥箱中干燥約3 h 至恒重，再置于PVC 塑料袋中封口保存待用。

1.2.2 形貌觀察 制得的納米纖維膜干燥后，噴金，掃描電鏡檢測，觀察納米纖維的形貌。

1.2.3 含藥量的測定 稱取干燥的60 mg 含有丹參素鈉的電紡纖維膜，加入到50 ml 的磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)中，在37℃恒溫水浴中振蕩72 h (70次/min)，離心10 min，吸取上層清液，用紫外可見吸收光譜儀在“丹參素鈉”的最大吸收波長λ=280 nm 處測定其吸光度。通過對比標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得藥物的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以通過檢測一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的丹參素鈉溶液的吸光度來進(jìn)行繪制，方程為:A=0.124C +0.0008，R2=0.9999。式中A 是吸光度值，C 是丹參素鈉溶液的濃度，單位為mg/L。載藥纖維的含藥量按下式計算:含藥量=ml/m，其中ml為載藥纖維中丹參素鈉量，m 為電紡纖維膜質(zhì)量。

1.2.4 體外釋藥曲線的測定 將干燥的載藥纖維膜(60 mg)置于盛有10 ml 磷酸緩沖溶液(PBS)(pH 7.4)的錐形瓶中，于37℃下恒溫振蕩，每隔一定時間取出1 ml 溶液，再向錐形瓶中加入等量的PBS 緩沖溶液，保持體積恒定。用紫外可見吸收光譜儀在“丹參素鈉”的最大吸收波長λ=280 nm 處測定其吸光度，由藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算藥物濃度及釋藥量，再計算累積釋藥百分率并作累積釋藥曲線。累計釋藥率=mt/m×100%，其中mt為釋放t 時刻丹參素鈉的累積釋放質(zhì)量，m 是載藥纖維中丹參素鈉的實(shí)際含量［11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同載藥量電紡纖維膜的形貌表征 加有6% SAS 的紡絲溶液無法紡絲，噴出的全為小液滴。將加有1%、2%、3%、4% SAS 的電紡纖維于掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)4 種藥物含量的紡絲液均可以成纖，但SAS 為4%的纖維有串珠狀結(jié)構(gòu)，且SAS 量越少其紡絲表面越光滑，串珠狀紡絲越少或沒有(圖1)。這是由于隨著SAS 量的增大，紡絲溶液可紡性變差，可能原因是PVA 和CS 均為大分子化合物，當(dāng)加入小分子化合物SAS 時，使噴射流表面的電荷密度增大，從而噴射流載有更多的電荷，在電場中受到更大的牽伸力，導(dǎo)致噴射流不穩(wěn)定［12］。通過測量不同載藥量的電紡纖維的直徑，發(fā)現(xiàn)纖維直徑與載藥量成反比，但差別不大，平均直徑在280～390 nm 之間。同時可以觀察到，藥物載入電紡纖維之后，沒有固相分離現(xiàn)象，也沒有藥物結(jié)晶顆粒出現(xiàn)，反映了藥物與成纖聚合物載體之間良好的相容性。其具體原因可能是在電紡過程由于高壓電場力的作用，溶劑迅速揮發(fā)，PVA/CS 快速成纖，抑制了藥物在纖維成纖過程中的晶核的形成以及微晶聚結(jié)成顆粒的現(xiàn)象，使得藥物在電紡纖維高度均勻分散。

2.2 載藥電紡纖維膜的紅外表征 圖2 顯示了PVA/CS 電紡纖維膜、丹參素鈉(SAS)以及PVA/CS/SAS 電紡纖維膜的紅外光譜。PVA/CS 電紡纖維膜的紅外光譜中，在3428 cm-1處有強(qiáng)而寬的歸屬于羥基和氨基的伸縮振動峰，2923 cm-1處為C-H 的伸縮振動峰，1079 cm-1處為β-D 吡喃葡萄糖苷的伸縮振動峰［13］。圖2(b)是丹參素鈉的紅外譜圖:1660 cm-1處為羰基伸縮振動峰，1567 cm-1和1470 cm-1處為苯環(huán)上碳碳骨架伸縮振動峰，1267 cm-1處是羰基面內(nèi)彎曲振動吸收峰，芳環(huán)上的C-H 面外彎曲振動峰出現(xiàn)在917～672 cm-1處。而PVA/CS/SAS 電紡纖維膜的紅外光譜中則在1652 cm-1、1563 cm-1、1467 cm-1以及1265 cm-1等處出現(xiàn)吸收峰。這些吸收峰分別與丹參素鈉的特征峰相對應(yīng)，但出現(xiàn)了一定的藍(lán)移，這可能是由于丹參素鈉中的羥基可與殼聚糖中的羥基、氨基及聚乙烯醇中羥基之間形成了較強(qiáng)的分子間的氫鍵。這些結(jié)果也表明，丹參素鈉分子與PVA 和CS 在載藥纖維中有很好的相容性。這對于載藥纖維的結(jié)構(gòu)和性能穩(wěn)定十分有利。作為一種藥用成分，藥物的化學(xué)穩(wěn)定性是其能否有效發(fā)揮藥效的關(guān)鍵所在。由圖2 可見，丹參素鈉的歸屬峰在載藥纖維的圖譜中均可見，說明在經(jīng)歷電紡高壓過程后藥物仍保持了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。這也就說明丹參素鈉在成功載入PVA/CS 纖維中后，仍然保持原有的藥物活性。

圖1 不同理論含藥量的聚乙烯醇/殼聚糖/丹參素鈉電紡纖維膜的電鏡照片F(xiàn)ig.1 FESEM micrographics of PVA/CS/SAS electrospun nanofibers of different theoretic drug loadings

圖2 不同樣品的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of different samples

2.2 含藥量及體外釋藥曲線的測定結(jié)果 理論含藥量不同的載藥電紡纖維膜的實(shí)際含藥量見表1。

表1 理論含藥量不同的聚乙烯醇/殼聚糖/丹參素鈉電紡纖維膜的含藥量Table 1 Entrapment efficiency of SAS in PVA/CS/SAS electrospun nanofibers with different theoretic drug-loading amount

表1 顯示PVA/CS/SAS 電紡納米纖維膜的實(shí)際含藥量均小于理論值。造成實(shí)際含藥量小于理論值的原因可能是:在靜電紡絲的過程中，有部分丹參素鈉藥物與載體材料發(fā)生結(jié)合，不能游離出來，或在噴絲過程，藥物發(fā)生一定的泄漏;此外，藥物的加入也使紡絲液的穩(wěn)定性稍稍變差，使得紡絲液的紡絲性能下降，紡絲液在電紡過程有少量損失，最終載入纖維中藥物的量略微減少［14］。

圖3 是不同含藥量的電紡纖維膜的釋藥曲線。由圖可知，4 種載藥纖維膜在最初8 h 內(nèi)都存在突釋現(xiàn)象，之后藥物釋放逐漸減緩。突釋現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于載藥纖維膜在釋藥過程中的釋放方式不同造成的。載藥纖維中藥物的釋放首先發(fā)生在纖維的表層，形成了快釋區(qū)。當(dāng)纖維表面的藥物釋放完畢后，纖維內(nèi)部的藥物要通過擴(kuò)散，才能到達(dá)纖維表面進(jìn)行釋放，由于擴(kuò)散速率相對于釋放速率相對平緩，因而形成藥物的緩釋區(qū)，釋放速度也相對平緩［15］。理論含藥量越高，前期釋藥速率更快，原因是含藥量越高的納米纖維，纖維的直徑相對較小且表面的藥物分布比較多。但隨著纖維膜中含藥量增加，藥物釋放度相應(yīng)有所提高。在36 h 內(nèi)，4 種載藥纖維膜均可實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放丹參素鈉。以上結(jié)果說明了以聚乙烯醇/殼聚糖為基質(zhì)的藥物載體對丹參素鈉藥物具有一定的緩釋作用。

圖3 不同理論含藥量的聚乙烯醇/殼聚糖/丹參素鈉電紡纖維膜的體外釋藥曲線Fig.3 In vitro release profiles of SAS from PVA/CS/SAS electrospun nanofibers of different theoretic drug-loading amount

3 結(jié)論

采用靜電紡絲技術(shù)制備了負(fù)載不同含量丹參素鈉的聚乙烯醇/殼聚糖載藥電紡纖維膜，掃描電鏡觀察制備的電紡纖維平均直徑在280～390 nm 之間。紅外光譜表明，丹參素鈉已經(jīng)成功載入電紡纖維中，并且仍然保持原有的藥物活性;通過對載藥纖維的釋藥性能考察發(fā)現(xiàn)，載藥纖維能較好地實(shí)現(xiàn)丹參素鈉的緩控釋放，有望應(yīng)用于皮膚局部給藥體系或傷口敷料領(lǐng)域。

［1］RUSSO G，LAMBERTI G.Electrospinning of drugloaded polymer systems:Preparation and drug release［J］.J Appl Polym Sci，2011，122(6):3551-3556.

［2］GAUTAM S，DINDA A K，MISHRA N C.Fabrication and characterization of PCL/gelatin composite nanofibrous scaffold for tissue engineering applications by electrospinning method ［J］.Mat Sci Eng C，2013，33(3):1228-1235.

［3］IGNATOVA M，RASHKOV I，MANOLOVA N.Drug-loaded electrospun materials in wounddressing applications and in local cancer treatment［J］.Expert Opin Drug Deliv，2013，10(4):469-483.

［4］WANG Wenjun，WU Xianzhong，YAO Zhi(王文俊，吳咸中，姚 智).The influence of emodin and Danshensu on monocyte's secretion of inflammatory cytokines［J］.Chinese Journal of Immunology(中國免疫學(xué)雜志)，1995，11(6):370-372.(in Chinese)

［5］SU Qinghe，YANG Minjie，ZHOU Hongmei，et al(蘇 青 和，楊 敏 杰，周 紅 梅，等).Effect of Danshensu on the burn wounds fibroblasts cells and collagen synthesis ［J］.Medical Journal of Communications(交通醫(yī)學(xué))，2003，17(6)，666-667.(in Chinese)

［6］WANG Yimin，WEI Fukang，LIU Min，et al (王益民，韋 福 康，劉 敏，等).Effect of salvia miltiorrhiza on autocrining growth factor by fibroblasts cultured in vitro［J］.Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery(中國修復(fù)重建外科雜志)，2002，16(6)，408-410.(in Chinese)

［7］JAYAKUMAR R，PRABAHARAN M，KUMAR P T S，et al.Biomaterials based on chitin and chitosan in wound dressing applications［J］.Biotechnol Adv，2011，29 (3):322-337.

［8］WANG T，ZHU X K，XUE X T，et al.Hydrogel sheets of chitosan，honey and gelatin as burn wound dressings［J］.Carbohyd Polym，2012，88(1):75-83.

［9］TCHEMTCHOUA V T，ATANASOVA G，AQIL A，et al.Development of a chitosan nanofibrillar scaffold for skin repair and regeneration ［J］.Biomacromolecules，2011，12(9):3194-3204.

［10］ARCHANA D，SINGH B K，DUTTA J，et al.In vivo evaluation of chitosan-PVP-titanium dioxide nanocomposite as wound dressing material ［J］.Carbohydr Polym，2013，95(1):530-539.

［11］RUJITANAROJ P O，POMPHA N，SUPAPHOL P.Wound-dressing materials with antibacterial activity from electrospun gelatin fiber mats containing silver nanoparticles ［J］.Polymer，2008，49(21):4723-4732.

［12］RENEKER D H，YARIN A L，F(xiàn)ONG H，et al.Bending instability of electrically charged liquid jets of polymer solutions in electrospinning［J］.J Appl Phys，2000，87(9):4531-4547.

［13］ZHEN Hongpeng，YANG Dongzhi，GUO Suang，et al(甄洪鵬，楊冬芝，郭 爽，等).Preparation and sustained release in vitro of ofloxacin loaded in chitosan/poly(vinyl alcohol)blend nanofibrous mats ［J］.Journal of Beijing University of Chemical Technology(北京化工大學(xué)學(xué)報)，2007，34(3):271-274.(in Chinese)

［14］NIE H，WANG C H.Fabrication and characterization of PLGA/Hap composite scaffolds for delivery of BMP-2 plasmid DNA ［J］.J Control Release，2007，120(1-2):111-121.

［15］PANYAM J，DALI M M，SAHOO S K，et al.Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D，L-lactide-co-glycolide)nanoand microparticles［J］.J Control Release，2003，92(1-2):173-187.