131I標(biāo)記殼聚糖/明膠—拓?fù)涮婵递d藥膜對SK—OV—3腹腔荷瘤鼠的治療效果

周文彬 呂昂 尹吉林 王瑞敏 張金赫 歐陽習(xí) 李林娟 王欣璐

[摘要] 目的 制備京尼平交聯(lián)的131I標(biāo)記殼聚糖/明膠-拓?fù)涮婵的?，并研究?fù)合膜對SK-OV-3荷瘤裸鼠的治療效果，為同步放化療載藥膜劑的腫瘤治療等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。 方法 制備SK-OV-3腹腔荷瘤裸鼠模型，并手術(shù)植入復(fù)合膜到荷瘤裸鼠腹腔中，觀察各組裸鼠的生存周期、轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水重量，考察復(fù)合膜對腹腔荷瘤裸鼠的治療效果。 結(jié)果 SK-OV-3腹腔荷瘤裸鼠經(jīng)手術(shù)植入復(fù)合膜后觀察各組生存天數(shù)、腹腔轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水量可知，同時(shí)應(yīng)用拓?fù)涮婵导?31I的131I+TPT組療效優(yōu)于單獨(dú)使用拓?fù)涮婵祷?31I，稍次于順鉑對照組，明顯優(yōu)于空白對照組。 結(jié)論 131I標(biāo)記的殼聚糖/明膠拓?fù)涮婵递d藥膜對SK-OV-3腹腔荷瘤裸鼠有一定療效，能延長荷瘤裸鼠的生存天數(shù)并抑制腹腔轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水的形成。

[關(guān)鍵詞] 殼聚糖；明膠；放射性碘標(biāo)記；載藥；腫瘤治療

[中圖分類號] R730.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）30-0028-04

[Abstract] Objective To prepare Genipin cross-linked 131I-labeled chitosan/gelatin-topotecan membrane， and to investigate the therapeutic effect of the composite membrane on the SK-OV-3 tumor-bearing nude mice， so as to provide a basis for the related research on tumor treatment of concurrent chemoradiotherapy-loaded drug-coated drugs. Methods SK-OV-3 peritoneal tumor-bearing nude mice model was prepared and surgically implanted into the abdominal cavity of tumor-bearing nude mice. The life cycle， metastatic tumor and blood ascites weight of nude mice in each group were observed. The therapeutic effect of composite membrane on abdominal cavity tumor-bearing nude mice was investigated. Results The survival days， abdominal metastases and blood ascites were observed in SK-OV-3 peritoneal tumor-bearing nude mice after surgical implantation of composite membrane. At the same time， the efficacy of the topotecan and 131I in the 131I+TPT group was better than that of topotecan or 131I alone， which was slightly lower than that of the cisplatin in the control group， but was significantly better than that in the blank control group. Conclusion 131I-labeled chitosan/gelatin topotecan drug-loaded membrane has a certain curative effect on SK-OV-3 peritoneal tumor-bearing nude mice， which can prolong the survival days of tumor-bearing nude mice and inhibit the formation of abdominal metastases and bloody ascites.

[Key words] Chitosan； Gelatin； Radioiodine labelling； Drug load； Tumor treatment

在此前的研究中，我們已經(jīng)制備了京尼平交聯(lián)的131I標(biāo)記殼聚糖/明膠-拓?fù)涮婵递d藥膜（131I-CS/G-TPT膜），該復(fù)合膜實(shí)現(xiàn)了化療藥物拓?fù)涮婵担═opotecan，TPT）的負(fù)載和131I的標(biāo)記，體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)復(fù)合膜的緩慢降解及緩慢釋藥，并在KM小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)復(fù)合膜在小鼠腹腔中生物相容性良好且降解緩慢，具備體內(nèi)應(yīng)用以治療腫瘤的應(yīng)用潛力。

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，以上皮癌最多見，發(fā)病率在各婦科腫瘤中位列第三，次于子宮頸癌及子宮體癌，但死亡率卻位居第一，發(fā)現(xiàn)時(shí)常已轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到子宮、雙側(cè)附件、大網(wǎng)膜及盆腔各器官，同時(shí)也常引起明顯的腹水癥狀。我國女性卵巢癌的死亡率為4.19/10萬，雖然不高，但由于卵巢癌的起病隱匿，進(jìn)展迅速，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅婦女健康、應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)預(yù)防的婦科腫瘤之一[1]。

拓?fù)涮婵涤上矘鋲A轉(zhuǎn)換而成，是一種水溶性的半合成喜樹堿衍生物，通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（TOPO）而產(chǎn)生抗瘤作用。拓?fù)涮婵凳敲绹鳩DA批準(zhǔn)的卵巢癌及小細(xì)胞肺癌二線化療用藥，常應(yīng)用于對順鉑抵抗而化療失敗的復(fù)發(fā)性卵巢癌及小細(xì)胞肺癌[2]，對順鉑（DDP）治療失敗的晚期卵巢癌患者，其療效達(dá)20.5%～25%[3-4]。已有實(shí)驗(yàn)表明，對SK-OV-3細(xì)胞株造模裸小鼠腹腔內(nèi)應(yīng)用TPT，較靜脈內(nèi)應(yīng)用TPT效果更佳[5]。同時(shí)，拓?fù)涮婵颠€是一種放射增敏劑，已有體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它的放射增敏作用[6-7]。

放射性粒子植入治療技術(shù)簡稱粒子植入，是一種將放射源植入腫瘤內(nèi)部，通過持續(xù)性近距離放射性治療以治療實(shí)體腫瘤，最常見的粒子為125-I粒子，常通過介入應(yīng)用于不可切除的實(shí)體腫瘤如前列腺癌、舌癌、縱隔內(nèi)惡性腫瘤[8-10]等。但是，粒子一經(jīng)植入后將長時(shí)間停留于植入位置，可能會(huì)產(chǎn)生粒子掉落、位移，或引起異物肉芽腫等不良反應(yīng)。再有，粒子為銀及鈦金屬所制，在CT掃描下會(huì)引起偽影，影響原有的CT掃描結(jié)果。因此，開發(fā)新一代具備生物相容性及體內(nèi)降解的放射性藥物的載體，極其需要。而131I-CS/G-TPT膜將可能在體內(nèi)腫瘤附近發(fā)揮作用的同時(shí)，緩慢釋放藥TPT，實(shí)施同步放化療。

1資料與方法

1.1一般資料

主要試劑：人卵巢腺癌細(xì)胞株SK-OV-3，廣州杰特偉生物科技有限公司；McCoy5A培養(yǎng)基，廣州杰特偉生物科技有限公司；PBS，Sigma公司；小牛血清，美國Gibco公司；胰蛋白酶，Sigma公司；DMSO，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；殼聚糖（脫乙酰度95%），阿拉丁試劑；明膠（化學(xué)純CP），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；拓?fù)涮婵?，上海北卡醫(yī)藥技術(shù)有限公司；131I-碘化鈉溶液，廣州原子高科同位素醫(yī)藥有限公司；異氟烷，深圳瑞沃德生物科技公司。

主要儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；超低溫立式冰箱，日本三洋公司；離心機(jī)，德國Eppendorf公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；小動(dòng)物麻醉儀，美國SurgiVet公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c-nu裸小鼠，雌性，4周齡，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心：SCXK（粵）2011-0015。倫理委員會(huì)批號：44002100011954。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及建立荷瘤鼠模型 取液氮中保存的人漿液性上皮性卵巢腺癌細(xì)胞株SK-OV-3，37℃水浴并輕搖凍存管至融化，取出解凍的懸浮液，緩慢移入含10%FBS的McCoy 5A培養(yǎng)基，于37℃、含5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中無支原體或細(xì)菌的污染。

將已達(dá)對數(shù)生長期的SK-OV-3單層貼壁細(xì)胞，經(jīng)0.05%胰蛋白酶消化后，用無血清的培養(yǎng)液清洗1次。1000 r/min離心5 min，去除上液后，PBS重懸，根據(jù)顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，稀釋并配備細(xì)胞計(jì)數(shù)為1107，體積為200 μL的SK-OV-3細(xì)胞注射液若干。置于4℃中待用，防止細(xì)胞黏連。

取4周齡BALB/c-nu裸小鼠（雌性），將含有SK-OV-3細(xì)胞注射液200 μL的1 mL注射器貼腹壁向小鼠頭部方向緩慢推進(jìn)針頭少許后，再以45°方向刺入腹腔，回抽確認(rèn)沒有刺入血管或腸道后，緩慢推出細(xì)胞注射液。腹腔注射細(xì)胞計(jì)數(shù)為1107的細(xì)胞注射液200 μL，稱重，單籠飼養(yǎng)。裸鼠于無特殊病原菌（Specific pathogen free，SPF）級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度（24±1）℃，相對濕度為（55±5）%，燈光循環(huán)周期為12 h，所用飼料、墊料及飲用水均經(jīng)高壓滅菌處理，所有飼養(yǎng)及操作程序均按照廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2 荷瘤鼠的分組及治療 取已接種SK-OV-3細(xì)胞14 d的裸小鼠，禁食24 h，誘導(dǎo)麻醉后小鼠呈仰臥位，四肢張開，暴露腹部，并佩戴小型動(dòng)物用面罩，維持麻醉。麻醉劑為液體異氟烷，倒入麻醉泵揮發(fā)罐中，空氣氣流吹氣揮發(fā)，誘導(dǎo)濃度為2%，維持濃度為2%。

無菌操作下碘伏擦拭，消毒表皮，沿腹中線作2～3 cm切口后，根據(jù)分組，對小鼠作相應(yīng)處理后，用非吸收線作逐層單純縫合。分組處理：空白組不作處理；順鉑組關(guān)腹后第1、2、3周分別腹腔注射稀鹽酸溶解0.2 mg/mL的順鉑溶液0.1 mL；TPT組放入1 cm2京尼平交聯(lián)的TPT-CS/G膜1塊；131I組放入1 cm2京尼平交聯(lián)的131I-CS/G膜1塊；131I-TPT組放入1 cm2京尼平交聯(lián)的131I-CS/G-TPT膜1塊。關(guān)腹后碘伏消毒表皮，每只鼠應(yīng)用鏈霉素溶液2萬單位，并根據(jù)分組作相應(yīng)標(biāo)記。所用手術(shù)器具均經(jīng)過高壓滅菌處理。撤出麻醉面罩，約2 min后裸鼠恢復(fù)清醒，術(shù)后送SPF屏障環(huán)境，單籠飼養(yǎng)。

1.2.3 荷瘤鼠的觀察及生存終結(jié) 生存期間觀察內(nèi)容：每3天測量體重1次，觀察并記錄動(dòng)物生長情況（體重增長或減少）、一般情況（行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍等疾病狀態(tài)）、貧血（耳廓蒼白）、腹水（腹部膨隆程度、顏色）、惡病質(zhì)等發(fā)生時(shí)間及生存期，密切觀察裸鼠生長狀態(tài)。記錄裸鼠存活天數(shù)，記錄時(shí)間為裸鼠接種SK-OV-3細(xì)胞起至裸鼠生存期終結(jié)。

裸鼠自然死亡或?yàn)l死（行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、體溫下降、腹部明顯膨隆及變紫青色）后，記錄小鼠存活時(shí)間，迅速處死小鼠并解剖裸鼠腹部，記錄胸腹腔內(nèi)各臟器腫瘤轉(zhuǎn)移情況、腹水量，留取腫瘤、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及受侵犯臟器組織。

1.3觀察指標(biāo)

①各組荷瘤裸鼠的生存天數(shù)；②各組荷瘤裸鼠死亡后的轉(zhuǎn)移瘤重量及血性腹水重量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本非參數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存周期觀察

不同分組荷瘤裸鼠的生存天數(shù)見表1，空白組、順鉑組、TPT組、131I組、131I+TPT組的平均生存天數(shù)為（46.80±6.05）d、（84.40±12.40）d、（68.80±4.12）d、（65.00±4.34）d、（78.60±3.83）d（n=5），其中空白組為空白對照組，順鉑組為陽性對照組，TPT組、131I組、131I+TPT組為實(shí)驗(yàn)組。與空白組對比，順鉑組、TPT組、131I組、131I+TPT組的P值均<0.01，結(jié)果均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示各組治療措施均對荷瘤裸鼠有一定效用。

2.2 轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水

裸小鼠腹腔接種人卵巢腺癌細(xì)胞株SK-OV-3后，最終將產(chǎn)生明顯腹腔轉(zhuǎn)移瘤及腹水。荷瘤裸鼠生存期結(jié)束后均進(jìn)行解剖，抽取腹腔內(nèi)不凝血性腹水，剝離腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤，并分別稱重記錄。不同分組荷瘤裸鼠的轉(zhuǎn)移瘤重量見表2，血性腹水重量見表3?？瞻捉M、順鉑組、TPT組、131I組、131I+TPT組的轉(zhuǎn)移瘤平均重量分別為（3.0±0.55）g、（1.51±0.22）g、（2.01±0.07）g、（2.05±0.10）g、（1.53±0.12）g（n=4），血性腹水平均重量分別為（4.41±0.22）g、（1.91±0.33）g、（3.48±0.30）g、（3.61±0.31）g、（2.05±0.46）g（n=4）。與空白組對比，順鉑組、TPT組、131I組、131I+TPT組的轉(zhuǎn)移瘤重量組間P值分別<0.01、<0.05、<0.05和<0.01，血性腹水重量組間P值分別<0.01、<0.01、<0.05和<0.01，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明本實(shí)驗(yàn)各治療手段對抑制荷瘤裸鼠的轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水的形成均具有一定作用。

3討論

3.1 生存周期觀察

與空白組對比，順鉑組、TPT組、131I組、131I+TPT組的P值均<0.01，結(jié)果均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示各組治療措施均對荷瘤裸鼠有一定效用。實(shí)驗(yàn)組的裸鼠生存天數(shù)整體長于空白對照組，即SK-OV-3荷瘤裸鼠經(jīng)植入TPT-CS/G膜、131I-CS/G膜及131I-CS/G-TPT膜后，生存天數(shù)整體較未作處理的SK-OV-3荷瘤裸鼠更高（P均<0.01），結(jié)果具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示各實(shí)驗(yàn)組的治療手段對荷瘤裸鼠均有治療作用；131I+TPT組裸鼠的生存天數(shù)優(yōu)于TPT組及131I組，組間P值均<0.01，結(jié)果具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示131I-CS/G-TPT膜對荷瘤裸鼠的治療效果優(yōu)于單純結(jié)合TPT或131I的CS/G膜；131I+TPT組裸鼠的生存天數(shù)稍次于順鉑組（P>0.05），結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示131I+TPT組的治療效果不如但接近于順鉑組；TPT組裸鼠的生存天數(shù)略高于131I組（P>0.05），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示兩組治療效果相接近。

順鉑作為卵巢癌治療的臨床一線用藥，其治療效果是備受肯定的。而拓?fù)涮婵狄驯幻绹鳩DA批準(zhǔn)為卵巢癌及小細(xì)胞肺癌的二線用藥，常用于順鉑等化療藥物耐藥的患者[11]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，131I+TPT的治療方案對SK-OV-3細(xì)胞株治療有效，但稍不如順鉑組的療效。這可能是因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)制備131I-CS/G-TPT膜中化療藥物及放療藥物劑量不足。CS/G膜的131I放射性活度本身不高，并隨著時(shí)間的推移進(jìn)一步衰減，而且，每1 cm2 CS/G膜中TPT平均每周釋放量較少，約為3.73 μg。有學(xué)者的體外實(shí)驗(yàn)表明，TPT對SK-OV-3有明顯的抑制作用，并呈明顯劑量依賴，其治療效果與順鉑相當(dāng)甚至更強(qiáng)[12]。以131I標(biāo)記的抗體對卵巢癌細(xì)胞殺傷作用的體外實(shí)驗(yàn)中也表明，其殺傷力呈一定的劑量依賴性[13]。與131I偶聯(lián)的單克隆抗體對SK-OV-3荷瘤裸鼠治療效果的探索實(shí)驗(yàn)中，對腫瘤生長的抑制作用也表現(xiàn)出劑量依賴性[14]。

3.2 轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水

與空白組對比，順鉑組、TPT組、131I組、131I+TPT組的轉(zhuǎn)移瘤重量組間P值分別<0.01、<0.05、<0.05和<0.01，血性腹水重量組間P值分別<0.01、<0.01、<0.05和<0.01，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明本實(shí)驗(yàn)各治療手段對抑制荷瘤裸鼠的轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水的形成均具有一定作用；131I+TPT組的轉(zhuǎn)移瘤重量與TPT組、131I組對比，P均<0.01，血性腹水重量與TPT組、131I組對比，P均<0.01，結(jié)果均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示131I-CS/G-TPT膜對抑制荷瘤裸鼠轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水形成的作用，均優(yōu)于單純結(jié)合131I或TPT的CS/G膜。

131I+TPT組的轉(zhuǎn)移瘤重量及血性腹水重量與順鉑組對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），表明131I+TPT組對荷瘤裸鼠轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水的抑制作用可能稍不如順鉑組，但差異并不明顯，表明131I+TPT組與順鉑組治療效果相近；TPT組的轉(zhuǎn)移瘤重量及血性腹水重量與131I組對比，P均>0.05，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示兩組的治療效用可能比較接近。

轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水的結(jié)果與表1中荷瘤裸鼠生存天數(shù)的結(jié)果趨勢有一定相似性，即順鉑組對荷瘤裸鼠的治療效果最佳，131I+TPT組稍次之但差異不大，TPT組及131I組更次之。大量研究已經(jīng)證實(shí)了順鉑經(jīng)腹腔給藥對轉(zhuǎn)移瘤及癌性腹水的抑制作用[15-16]，這也側(cè)面佐證了131I+TPT組對荷瘤裸鼠轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水的抑制作用。

131I標(biāo)記殼聚糖/明膠-拓?fù)涮婵递d藥膜應(yīng)用于SK-OV-3荷瘤裸鼠腹腔中，對比空白組，載藥膜對荷瘤裸鼠具備一定的治療效果，能延長荷瘤裸鼠的生存期，抑制裸鼠腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤及血性腹水的形成；其治療效果優(yōu)于單獨(dú)使用拓?fù)涮婵祷?31I，療效稍遜于順鉑。若提高復(fù)合膜拓?fù)涮婵岛停ɑ颍?31I的載藥量，單位面積的載藥膜治療效果可能接近或優(yōu)于順鉑。

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（收稿日期：2018-07-11）