玻璃化冷凍對人卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及組織增殖活性的影響

潘永苗，徐向榮，錢羽力，周彩云，徐 鍵

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

近年來，新的化療和放療方案應(yīng)用，使得患有惡性腫瘤的年輕婦女生存率有了較大的提高，但化療和放療極易造成卵巢組織不同程度甚至永久性損傷，引起患者月經(jīng)失調(diào)、閉經(jīng)、卵巢早衰，甚至喪失生殖和內(nèi)分泌能力。如何保存此類年輕婦女的卵巢功能成為迫切需要解決的問題。卵巢組織冷凍保存是一種較有前途的卵巢功能保存方法。但冷凍可能對卵巢組織尤其是卵細胞造成不同程度的冷凍損傷，從而影響卵巢組織的凍存效率。本研究采用麥管玻璃化冷凍人類卵巢組織，與新鮮卵巢組織比較，探討玻璃化冷凍對人類卵巢組織中卵泡組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)以及細胞增殖活性的影響，為探索卵巢組織凍融方法和進一步在體外培養(yǎng)、移植等研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 卵巢組織取自12 例來浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院行腹腔鏡下或進腹手術(shù)行卵巢良性囊腫切除的患者;術(shù)中取囊腫被覆上皮或修剪整形卵巢組織多余上皮。病理診斷:10 例為卵巢畸胎瘤，2 例單純性囊腫。年齡25～37歲，月經(jīng)規(guī)律，無痛經(jīng)史，無內(nèi)分泌疾病和服激素藥物史，無化療放療史。卵巢組織冷凍保存經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集的人卵巢組織放入室溫保存的磷酸鹽緩沖液中迅速轉(zhuǎn)移至實驗室。清洗組織，剔除卵巢髓質(zhì)保留皮質(zhì)部分，將卵巢組織在室溫磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌5次，用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，每例標(biāo)本預(yù)留2 塊作為新鮮組(A組)，經(jīng)40 g/L 中性甲醛固定后行常規(guī)石蠟包埋切片;余組織塊作為玻璃化冷凍組(B組)。

1.2.2 組織玻璃化冷凍 將處理后的組織塊浸泡在快速冷凍液中(含有5.5 mol/L 乙二醇、1.0 mol/L 蔗糖、10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液)，在室溫下平衡10 min，用麥管(0.25 ml)按3 段式法裝管，封口泥封口后直接投入液氮中保存1 周。

1.2.3 解凍復(fù)蘇 玻璃化凍存的卵巢組織塊采用3 步法依次在含有1.0 mol/L 蔗糖和10%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，0.5 mol/L 蔗糖和5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液，以及0.25 mol/L蔗糖和2.5%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中逐步稀釋去除冷凍保護劑，每次平衡10 min，最后在磷酸鹽緩沖液中沖洗2次(每次5 min)。將解凍的卵巢組織分別放入25 g/L 戊二醛和福爾馬林(40 g/L)中固定。

1.3 組織學(xué)檢查 將新鮮固定組織和凍融復(fù)蘇后固定組織塊常規(guī)脫水、透明，每塊組織單獨石蠟包埋，以4μm 厚度連續(xù)切片，HE 染色后光鏡下讀片統(tǒng)計。依據(jù)Gougeon標(biāo)準(zhǔn)觀察卵泡形態(tài):卵泡和卵母細胞均呈圓形，卵母細胞核無固縮，顆粒細胞分布均勻，基底膜完整的為正常卵泡結(jié)構(gòu);卵泡結(jié)構(gòu)不完整或消失，卵母細胞核固縮或皺縮，顆粒細胞排列紊亂的為異常卵泡。統(tǒng)計每片中形態(tài)正常和異常的原始和初級卵泡比例。

1.4 免疫組化測定卵巢組織中增殖細胞核抗原(PCNA)表達 采用組織學(xué)檢查的切片(PCNA 試劑盒購自北京中衫金橋公司)，Envision 二步法操作測定。結(jié)果判定以光鏡下組織細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞核內(nèi)見棕黃色顆粒沉著，染色明顯高于背景為陽性細胞;卵母細胞或顆粒細胞PCNA 陽性表達為PCNA 陽性卵泡。同時，計數(shù)陽性卵泡比例數(shù)(PCNA 陽性卵泡/卵泡總數(shù))。

1.5 電鏡檢查 在A組新鮮組織塊和B組凍融組織塊中各選2 塊卵巢組織，經(jīng)25 g/L 的戊二醛固定、包埋修塊后半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位組織學(xué)形態(tài)正常的原始卵泡，超薄切片后經(jīng)醋酸鈾及硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察卵泡超微結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 比較新鮮組織和凍融組織中原始卵泡和初級卵泡分布和形態(tài)正常比例，以及PCNA 陽性卵泡比例采用χ檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組卵巢組織光鏡觀察結(jié)果

2.1.1 新鮮和凍融卵巢組織卵泡計數(shù) 兩組卵巢組織中主要為原始卵泡，初級卵泡明顯少于原始卵泡。A組中卵泡185個，其中原始卵泡146個(86.4%)，初級卵泡39個(13.6%);B組中卵泡162個，其中原始卵泡137個(84.5%)，初級卵泡25個(15.5%)。A、B 兩組原始和初級卵泡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ=1.37，P ＞0.05)。

2.1.2 新鮮和凍融卵巢組織形態(tài) A、B 兩組卵巢組織中原始卵泡大多數(shù)形態(tài)正常，分別占75.3%和69.3%，形態(tài)正常的卵泡保持圓形或橢圓形，卵母細胞核完整，顆粒細胞排列均勻，未見核固縮(圖1)。但觀察到部分卵泡形態(tài)異形，卵母細胞核面積縮小或固縮，胞漿比例增大，顆粒細胞排列疏松或紊亂，基底膜欠完整，部分卵泡閉鎖(圖2)。與A組比較，玻璃化凍融后原始卵泡光鏡下形態(tài)異常率無顯著性差異(P＞0.05)。但是，其初級卵泡凍融后形態(tài)異常的比例(56%)高于新鮮組織(28.2%，P＜0.05)。

表1 新鮮組和凍融組中卵泡形態(tài)正常和異常的比例變化Table 1 The proportion of follicles with normal and abnormal morphology in fresh and frozen-thawed tissue ［n，(%)］

2.2 新鮮和凍融卵巢組織PCNA 表達 新鮮和凍融后卵巢組織均可見PCNA 陽性表達，表達主要位于原始卵泡、初級卵泡以及間質(zhì)細胞核內(nèi)(圖3A、圖3B)。新鮮組織PCNA 陽性卵泡比例為15.5%，凍融組織中陽性卵泡比例為13.5%，兩組比較差異無顯著性(P ＞0.05)。

圖3 PCNA 陽性表達于新鮮卵巢組織(A) 和凍融卵巢組織(B) 卵母細胞、顆粒細胞和間質(zhì)細胞(×400)Fig.3 Positive expression of PCNA in oocyte and granulsa and stromal cells in fresh tissue(A) and frozen-thawed tissue(B) (envision system staining×400)

2.3 兩組卵巢組織電鏡觀察結(jié)果 A、B 兩組中均可見超微結(jié)構(gòu)正常的原始卵泡，卵母細胞居中、圓形，核膜及核仁清晰完整，卵母細胞膜、核膜與線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜完整，顆粒細胞膜完整，排列整齊，細胞間連接緊密，細胞核完整，染色質(zhì)分布均勻(圖4A)。但在凍融組初級卵泡中可見卵母細胞和前顆粒細胞胞漿內(nèi)基質(zhì)電子密度略有下降，部分線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹并出現(xiàn)小空泡(圖4B、圖4C);個別卵母細胞及顆粒細胞胞漿中存在無細胞器區(qū)和空泡增多，嚴重者核膜局部凹陷甚至破裂(圖4C)。

圖4 新鮮和凍融卵巢組織的超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of fresh and frozen-thawed ovarian tissue ultrastructure

3 討論

慢凍速融和玻璃化冷凍是卵巢組織冷凍保存的主要方法，玻璃化冷凍技術(shù)由于保存和保持組織細胞溶液內(nèi)水分子和離子的分布，極大地避免了細胞內(nèi)冰晶的形成，因此冷凍保存后對人卵巢組織內(nèi)原始卵泡和顆粒細胞的組織結(jié)構(gòu)影響相對較小，但目前經(jīng)典的慢凍速融比較玻璃化冷凍技術(shù)對卵泡質(zhì)量和復(fù)蘇后卵巢組織生物活性的影響尚有爭議。玻璃化冷凍技術(shù)有較多種改良方法，其中組織物直接與液氮接觸能提高冷凍速率，但存在被微生物或病毒污染的可能，本實驗采用較為安全的、不與液氮直接接觸的麥管裝載法玻璃化冷凍人卵巢組織，復(fù)蘇后光學(xué)顯微鏡下檢查原始卵泡分布比例為84.5%，與文獻報到的70%～90%基本一致，原始卵泡卵母細胞和顆粒細胞異常率(30.7%)與新鮮組織(24.7%)比較也無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)，而初級卵泡形態(tài)學(xué)異常率高于新鮮組織。這提示玻璃化冷凍對體積相對較大的初級卵泡細胞容易造成損傷，對體積較小的原始卵泡有較好的冷凍保持效率，光鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯影響。

動物實驗顯示，小鼠卵巢組織玻璃化冷凍后原始卵泡的超微結(jié)構(gòu)無明顯改變，而在人類卵巢組織研究中發(fā)現(xiàn)，無論慢凍速融和玻璃化冷凍卵巢組織原始卵泡均有一定程度的超微結(jié)構(gòu)改變，這些細微的結(jié)構(gòu)改變是否對進一步的組織移植后生物活性產(chǎn)生影響，則較難精確預(yù)測，原始卵泡發(fā)育潛能需經(jīng)過組織培養(yǎng)和移植物檢測得以驗證。本實驗對光鏡檢查無明顯改變的組織細胞進一步作了透射電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)部分卵泡超微結(jié)構(gòu)有一定改變，主要表現(xiàn)為部分細胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹并出現(xiàn)少量小空泡，卵母細胞和前顆粒細胞胞漿內(nèi)基質(zhì)電子密度有下降，個別卵母細胞及顆粒細胞胞漿中存在無細胞器區(qū)和空泡增多，核膜凹陷，也可見部分顆粒細胞膜的不完整，這種改變在初級卵泡多見，這可能與初級卵泡代謝較原始卵泡旺盛，更容易發(fā)生冷凍損傷或組織離體后短時的缺血缺氧等有關(guān)。在原始卵泡這種超微結(jié)構(gòu)的改變較少見，而且不明顯。Stefania等研究發(fā)現(xiàn)，原始卵泡即使發(fā)生這種細微和暫時的冷凍損傷可能為復(fù)蘇后組織移植存活后細胞本身所修復(fù)，并能進一步發(fā)育成初級卵泡。PCNA 表達是卵泡啟動生長的最早期指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，新鮮和凍融卵巢組織中PCNA 均有表達，主要集中在卵母細胞、顆粒細胞和間質(zhì)細胞，兩者比較無統(tǒng)計學(xué)差異。由此推測，玻璃化冷凍能有效地保存卵巢組織中的卵泡，尤其是原始卵泡，對其組織學(xué)形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及啟動進一步發(fā)育潛能影響甚小。但玻璃化冷凍復(fù)蘇異體移植后可觀察到卵母細胞和顆粒細胞早期發(fā)育的非同步化，這是否對卵泡進一步發(fā)育造成影響有待研究。

卵巢組織的冷凍保存成為繼胚胎和卵細胞冷凍之外保存女性生殖和內(nèi)分泌能力的又一極具潛力手段。卵巢組織內(nèi)存在大量體積小、結(jié)構(gòu)簡單、代謝率低、對溫度低敏感的未成熟卵母細胞，其為有效凍存提供了基礎(chǔ)。隨著研究深入，玻璃化冷凍不失為一種簡單而有效的凍存卵巢組織的基礎(chǔ)技術(shù)之一。

［1］MICHAEL V W，JACQUES D，OUTI H，et al.Cryopreservation and autotransplantation of human ovarian tissue prior to cytotoxic therapy– A technique in its infancy but already successful in fertility preservation［J］.Eur J Cancer，2009，45(9):1547-1553.

［2］JACQUES D，PASCALE J，JEAN S，Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in cancer patients［J］.Best Pract Res Clin Obstet and Gynecol，2010，24(1):87-100.

［3］CHEN S U，CHIEN C L，WU M Y，et al.Novel direct cover vitrification for cryopreservation of ovarian tissues increases follicle viability and pregnancy capability in mice ［J］.Hum Reprod，2006，21(11):2794-2800.

［4］VICTORIA K，SUSANNA X，KJELL H.Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue ［J］.Hum Reprod，2009(24):1670-1683.

［5］GOUGEON A.Dynamics of follicular growth in the human:a model from preliminary results［J］.Hum Reprod，1986，1(2):81-87.

［6］GANDOLFI F，PAFFONI A，PAPASSO BE，et al.Eficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the cryopreservation of ovarian tissue:comparative analysis between human an d animal models ［J］.Fertil Steril，2006，85(Supp1):1150-1156.

［7］XIN H Z，YI-J W，JIN S.Cryopreservation of human ovarian tissue:Comparison of novel direct cover vitrification and conventional vitrification ［J］.Cryobiology，2010(60):101-105.

［8］ISACHENKO V，LAPIDUS I，ISACHENKO E，et al.Human ovarian tissue vitrification versus conventional freezing:morphological，endocrinological，and molecular biological evaluation ［J］.Reproduction，2009，138:319-327.

［9］LI Y B，ZHOU C Q，YANG，G F，et al.Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissue［J］.Chinese Med J(Engl)，2007，120:110-114.

［10］ISACHENKO V，ISACHENKO E，KREIENBERG R，et al.Human ovarian tissue cryopreservation:quality of follicles as a criteria of effectiveness［J］.Reprod Bio Med Online，2010(20):441-442.

［11］ANDERSON R A，WALLACE W H B，BAIRD D T.Ovarian cryopreservation for fertility preservation:indications and outcomes ［J］.Reproduction，2008，136:681-689.

［12］LH W，MULLEN S F，LI Y，et al.Morphological and apoptotic comparison of primordial and primary follicles in cryopreserved human ovarian tissue［J］.Reprod Dom Anim，2009，44:879-883.

［13］STEFANIA A N，ALESSANDRA C，ANNE V L，et al.Cryopreservation and xenotransplantation of human ovarian tissue:an ultrastructural study［J］.Fertil and Steril，2008，90(1):23-32.

［14］OKTAY K，SCHENKEN R S，NELSON J E.Proliferation cell nuclear antigen marks the initiation of follicular growth in the rat［J］.Biol Reprod，1995，53(2):295-301.