AGTR1基因多態(tài)性與糖尿病腎病易感性相關

尹雪瑤，李 紅，宣君麗，陳怡馨，李 霖，董雪紅

(浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院內(nèi)分泌科浙江省生物治療重點實驗室，浙江杭州 310016）

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)發(fā)病的主要原因，但其發(fā)病機制尚未明了?，F(xiàn)有研究表明，DN可能是遺傳因素和環(huán)境因素等綜合作用的結果。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renninsystem，RAS)被認為在糖尿病腎病發(fā)生過程中起重要作用，Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體(angiotensinⅡtypeⅠreceptor，AGTR1)介導了血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)的主要生物學效應，因而AGTR1基因一直是糖尿病腎病研究的熱點。本研究運用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術研究AGTR1 A1166C基因多態(tài)性在正常對照組、2型糖尿病非腎病組及糖尿病腎病組中分布頻率，以探討AGTR1基因與2型糖尿病及糖尿病腎病的相關性。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象 研究對象均為浙江省杭州市社區(qū)居民，漢族，彼此間無血緣關系。均簽署知情同意書。

1.1.1 糖尿病組 據(jù)1999年WHO糖尿病診斷和分型標準，入選2型糖尿病患者293例，發(fā)病年齡＞35歲。根據(jù)尿白蛋白/肌酐比值(A/C比值)分為兩組，糖尿病非腎病組:A/C比值＜30 mg/g肌酐，共141例，其中男性73例，女性68例，病程≥10年，年齡(52.99±5.39)歲，未服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ACEIARB)藥物;糖尿病腎病組:6個月內(nèi)連續(xù)3次晨尿檢查有2次A/C比值≥30 mg/g肌酐，共152例，其中，男性65例，女性87例，年齡(69.63±7.64)歲。糖尿病腎病組中微量白蛋白尿(30 mg/g肌酐≤A/C比值＜300 mg/g肌酐)109例，大量白蛋白尿(A/C比值≥300 mg/g肌酐)43例。所有患者臨床排除原發(fā)腎臟疾病、結締組織疾病、泌尿系感染、糖尿病急性代謝并發(fā)癥、急慢性感染、肝臟疾病、心力衰竭等。

按照改良的 MDRD公式計算腎小球濾過率(glomerular filtration rate，eGFR)，并根據(jù)eGFR將糖尿病患者分為兩組，eGFR下降組:eGFR＜60 ml/(min/1.73 m)共90例;eGFR 正常組:eGFR≥60 ml/(min/1.73 m)共203例。

1.1.2 正常對照組 體檢健康者，無糖尿病、高血壓及腎臟疾病家族史，且葡萄糖耐量試驗排除糖尿病和糖調(diào)節(jié)異常，共157例，其中，男性65 例，女性92 例，年齡(68.21 ±9.69)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床和生化檢查 測晨8:00～9:00時坐位測量右上臂肱動脈收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)3次，取其平均值。測量腰圍、身高、體重，根據(jù)BMI=體重/身高(kg/m)計算體質(zhì)指數(shù)。取空腹靜脈血測定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)，糖化血紅蛋白(HbAc)。留取晨尿，測定尿白蛋白和肌酐，通過免疫散射比濁法測定尿白蛋白，并計算A/C比值。

1.2.2 AGTR1基因多態(tài)性的檢測 按照DNA提取試劑盒操作方法提取外周血DNA，引物參照Doria等的設計，由上海Invotrogen公司合成。引物1:5'-CAC CAT GTT TTG AGG TT-3'，引物 2:5'-CGA GTT TCT GAC ATT GTT C-3。以PCR擴增目的基因，反應步驟:95℃預變性10 min，95℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共循環(huán)30次，72℃終末循環(huán)10 min，最后置于4℃終止反應。A1166C變異導致DdeⅠ限制性內(nèi)切酶切位點的出現(xiàn)。PCR產(chǎn)物用DdeⅠ于37℃酶切4 h。2%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓120 V+電泳液為1×TAE)，紫外燈下觀察結果。

PCR擴增產(chǎn)物為AGTR13'端非編碼區(qū)5'末端1058～1331 bp之間274 bp的DNA。擴增產(chǎn)物中無A1166C突變切點則為274 bp片段，若擴增片段中存在A-C堿基替換則產(chǎn)生DdeⅠ切點，經(jīng)酶切后產(chǎn)生165 bp和109 bp的片段。AA基因型只有一條274 bp片段，CC基因型含有165 bp和109 bp 2條片段，含有以上3條片段的為AC雜合基因型(圖1)。選取部分樣本PCR后測序，鑒定基因型與酶切結果(圖2)。

圖1 AGTR1基因型DdeⅠ酶切電泳結果Fig.1 Result of genotypes of AGTR1 gene detected by DdeⅠdigestion

圖2 AGTR1基因型測序結果Fig.2 Result of AGTR1 genotype sequencing

2 結果

2.1 各組間臨床和生化指標的比較 與正常對照組比較，糖尿病非腎病組年齡、男性比例、腰圍、BMI、SBP、Scr、FPG、LDL-c、HbAc、A/C比值均高于正常對照組，TC值低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);糖尿病腎病組年齡、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、LDL-c、HbAc、A/C比值均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而糖尿病腎病組與糖尿病非腎病組比較，糖尿病腎病組BMI、TG、A/C比值顯著高于糖尿病非腎病組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結果見表1和表2。

表1 正常對照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組的臨床資料Table 1 Clinical data of the normal controls，simple diabetes and diabetic nephropathy groups

表2 正常對照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組的生化指標Table 2 Laboratory data of the normal controls，simple diabetes and diabetic nephropathy groups

2.2 各組AGTR1 A1166C變異分布頻率 表3示正常對照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組等位基因分布情況，各組研究對象基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。在正常對照組、糖尿病非腎病組、糖尿病腎病組A和C等位基因的分布頻率分別為 96.5%、97.2%、92.8% 和 3.5%、2.8%、7.2%。其中，糖尿病腎病組C等位基因頻率明顯高于正常對照組(χ=4.26，P ＜ 0.05)和糖尿病非腎病組(χ=5.83，P ＜0.05)，而糖尿病非腎病組和正常對照組等位基因分布未見明顯差異(χ=0.21，P ＞0.05)。ACCC 基因型頻率在糖尿病腎病組與正常對照組或糖尿病非腎病組間存在統(tǒng)計學差異(χ=3.86，P ＜0.05 或 χ=5.44，P＜0.05)。

糖尿病腎病組中的微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組A等位基因和C等位基因分布頻率分別為 91.3%、96.5% 和 8.7%、3.5%。兩組間等位基因及基因型頻率比較無統(tǒng)計學意義(χ=2.355，P ＞0.05 和 χ=2.51，P ＞0.05)，見表4。

表3 正常對照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組的基因型和等位基因分布Table 3 Distribution of genotypes and allele frequency in normal controls，simple diabetes and diabetic nephropathy groups ［n(%)］

表4 微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組基因型和等位基因分布Table 4 Distribution of genotypes and allele frequency in microalbuminuria and proteinuria groups［n(%)］

2.3 糖尿病患者腎病和非腎病組及eGFR正常和下降組Logistic回歸分析 以糖尿病患者是否發(fā)生腎病為分類變量，以年齡、性別、腰圍、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、TC、LDL、HDL、HbAc和AGTR1 A1166C基因型為自變量進行Logistic回歸分析，經(jīng)逐步選擇表明，高 BMI、DBP、TG和AGTR1ACCC基因型為糖尿病發(fā)生腎病的獨立危險因素，ACCC基因型與AA基因型相比對，糖尿病腎病比值比(OR)為2.672(95%CI:1.170 ～ 6.104)，用 Logistic 回歸校 正 后 OR 為 3.184(95%CI:1.277 ～7.934)，見表5。

以糖尿病患者是否發(fā)生eGFR下降為分類變量，以年齡、性別、病程、腰圍、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、TC、LDL、HDL、HbAc、A/C 和AGTR1基因型為自變量進行Logistic回歸分析，經(jīng)逐步選擇表明，男性、高TG和A/C為糖尿病患者發(fā)生eGFR下降的獨立危險因素，而AGTR1 A1166C基因型未進入方程(表5)。

表5 糖尿病患者腎病和非腎病組及eGFR正常和下降組Logistic回歸分析Table 5 Logistic regression analysis in simple diabetes and diabetic nephropathy groups，and eGFR normal and low groups

3 討論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(reninangiotensin-aldosterone system，RAAS)內(nèi)的基因一直被認為是糖尿病腎病的重要候選基因。因為該系統(tǒng)對于全身和腎臟內(nèi)的血液動力學具有明顯的調(diào)控作用。在糖尿病患者中AngⅡ?qū)τ诮M織的損害，除了通過激活血管緊張素受體和下游的通路，還可通過與其他經(jīng)典的高血糖誘導的病理生理途徑的相互作用(如氧化應激，糖基化終末產(chǎn)物，蛋白激酶C、多元醇途徑，己糖胺途徑)發(fā)揮作用。

改善血糖和控制血壓，以及應用RAAS抑制劑后可明顯延緩糖尿病腎病的發(fā)生，但仍有相當數(shù)量的糖尿病患者雖血糖控制良好仍進展為糖尿病腎病，這表明糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展存在著個體易感性。大量的研究表明基因背景決定了糖尿病患者進展為糖尿病腎病的風險，無論是蛋白尿或腎小球損傷的程度，及患者的藥物治療效果都存在著明顯的家族聚集性［6］。

人類AGTR1基因位于3q21-25，僅含1個外顯子，無內(nèi)含子區(qū)域。A1166C位于3'端非編碼區(qū)域，不編碼蛋白質(zhì)，可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮作用。關于AGTR1 A1166C基因多態(tài)性和糖尿病腎病關系的研究結果并不盡一致。Doria等發(fā)現(xiàn)，C等位基因同血糖控制不佳的糖尿病患者腎病的發(fā)生相關，而Tomino等對于日本2型糖尿病婦女的研究也發(fā)現(xiàn)，C等位基因與糖尿病腎病的進展相關。在體外C等位基因還可介導AngⅡ的作用增強。Chowdhury等的研究卻并未發(fā)現(xiàn) A1166C與糖尿病腎病的發(fā)生相關。另外有研究發(fā)現(xiàn)，AA基因型與非糖尿病患者的腎病的迅速發(fā)展相關［10］。

本研究以社區(qū)人群為研究對象，可使基因型更符合人群中的分布，再者，糖尿病非腎病組篩選病程≥10年，而且為未服用ACEIARB類藥物的2型糖尿患者，可排除短病程、藥物等因素對于該組患者尿蛋白排泄的影響，使結果更可靠。但是，由于36.18%糖尿病腎病患者服用ACEIARB類藥物，該類藥物對糖尿病腎病組患者腎功能和尿蛋白的影響未能完全排除。另外，由于大量白蛋白尿組樣本量較小，也可能掩蓋了基因多態(tài)性對于糖尿病腎病進展的影響。

本研究顯示，糖尿病腎病組C等位基因的頻率顯著高于正常對照組和糖尿病非腎病組，而正常對照組和糖尿病非腎病組間未見統(tǒng)計學差異，表明AGTR1基因是糖尿病腎病的易感基因(OR=2.672，95%CI:1.170 ～6.104)，而非糖尿病易感基因。經(jīng)Logistic回歸分析表明高BMI、DBP、TG和AGTR1基因型中 C等位基因為糖尿病腎病獨立風險因素，該研究結果與國內(nèi)外研究結果相一致。但由于基因作用的復雜性，AGTR1 A1166C參與糖尿病腎病的發(fā)生分子機制仍有待進一步的研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)AGTR1 A1166C基因多態(tài)性和糖尿病腎病的易感性相關。對于糖尿病腎病易感基因的深入研究，將有助于糖尿病腎病高?；颊叩脑缙诤Y查、靶向治療及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。此外，不同基因型的患者對藥物也有不同的反應，進一步的研究對于指導臨床用藥也具有重要的意義。

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