姜黃素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK通路過度活化減輕小鼠肺缺血再灌注損傷*

趙 珊， 馬迎春， 劉亞坤， 周俊輝， 郝卯林， 陳海娥， 孫 勤， 王萬(wàn)鐵△

近年來隨著體外循環(huán)技術(shù)的不斷開展，肺缺血/再灌注(ischemia reperfusion，I/R)所致的嚴(yán)重肺損傷越來越受到重視。研究提示，肺I/R過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激［1］、ATP 耗竭及細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡［2］等因素將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，適度的ERS有利于細(xì)胞恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持存活，但持續(xù)或高強(qiáng)度的ERS則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3］，從而進(jìn)一步加重肺I/R損傷。研究表明，干預(yù)細(xì)胞凋亡對(duì)I/R肺損傷具有一定的防治作用［4］。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族中重要的通路之一，存在于多種生命活動(dòng)過程中且易受多種細(xì)胞外應(yīng)激因素激活并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。隨著對(duì)ERS研究的深入，已證實(shí)JNK信號(hào)通路參與介導(dǎo)了過度ERS中引發(fā)的細(xì)胞凋亡。

姜黃素(curcumin，Cur)是中藥姜黃的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗肺動(dòng)脈高壓、抗腫瘤等［6-7］作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Cur在心［8］、腦［9-10］等多種重要器官的I/R損傷中發(fā)揮良好的保護(hù)作用［11］。因此我們推斷，Cur可能對(duì)治療肺I/R損傷也會(huì)有較好效果。目前的研究結(jié)果提示，Cur可能通過抑制ERS下的JNK通路發(fā)揮對(duì)肺的保護(hù)。本研究通過建立小鼠左側(cè)原位肺I/R損傷模型，以Cur對(duì)I/R模型進(jìn)行干預(yù)，探討Cur能否通過抑制ERS下的JNK通路的過度活化來對(duì)抗肺I/R損傷，以期為Cur臨床治療肺I/R損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠60只，平均體重(20±2)g。由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2010-0150］。

2 主要試劑

姜黃素(Sigma)，In Situ Cell Death Detection Kit，POD(Roche)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(Fermentas Life Science);兔抗GAPDH多克隆IgG抗體(中國(guó)杭州賢至生物科技有限公司)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)Ⅰ抗、JNKⅠ抗和磷酸化JNK(p-JNK)Ⅰ抗(Cell Signaling Technology)，Ⅱ抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所)，DAB顯色試劑盒(×20)(北京中杉金橋生物科技有限公司)，DNaseⅠ(Sigma)，其余均為市售分析純。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型復(fù)制 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法復(fù)制小鼠原位肺 I/R模型［12］。小鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮(0.1 mg/g)+賽拉嗪(0.01 mg/g)進(jìn)行麻醉。切開氣管，氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為:潮氣量0.6 mL，呼吸頻率120 min－1，吸呼比3∶2。電熱毯保溫，監(jiān)測(cè)體溫。沿左胸骨斷開第2、3肋骨，打開胸腔，暴露左肺，找到左肺門并以微型動(dòng)脈夾夾閉30 min，即為缺血期;之后松開動(dòng)脈夾，形成再灌注期，再灌注3 h。

3.2 Cur藥物干預(yù)分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組，每組10只:sham組:只開胸不夾閉肺門，觀察3.5 h后處死并取左肺;I/R組:阻斷左肺門30 min，再灌注3 h，處死取左肺;I/R+DMSO組:于缺血前2 h經(jīng)腹腔注射10%DMSO(20 mL/kg)，余同I/R組;I/R+Cur低、中、高劑量組:于缺血前2 h經(jīng)腹腔注射不同劑量(低劑量為100 mg/kg，中劑量為150 mg/kg，高劑量為200 mg/kg)Cur溶液，余同I/R組。

3.3 肺濕干重比(wet/dry weight ratio，W/D)和總肺水含量(total lung water content，TLW)檢測(cè) 取左肺上葉組織，用生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱重為濕重;在恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱70℃24 h烘干后稱重為干重，兩者之比為肺W/D。TLW的計(jì)算公式如下:TLW=(W－D)/D。

3.4 肺組織光鏡檢測(cè)及肺泡損傷定量評(píng)估指數(shù)(index of quantitative assessment，IQA) 檢測(cè) 按 文獻(xiàn)［13］，取左肺下葉約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小肺組織，經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察各組標(biāo)本組織學(xué)改變。在400倍視野下隨機(jī)連續(xù)觀察50個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的總肺泡數(shù)及損傷肺泡數(shù)。肺泡內(nèi)含紅細(xì)胞或白細(xì)胞超過2個(gè)以上或肺泡內(nèi)含有水腫滲出液的均視為損傷肺泡。把損傷肺泡數(shù)占總計(jì)肺泡數(shù)百分比的值作為IQA。

3.5 肺組織電鏡檢測(cè) 取左肺近肺門處約1 mm×1 mm×1 mm大小的肺組織若干小塊，經(jīng)2.5%戊二醛前固定，再依次經(jīng)1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，酒精梯度脫水，丙酮浸透，Epon 812包埋聚合，半薄切片和超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色后，于電鏡下觀察各標(biāo)本組織學(xué)改變結(jié)果。

3.6 RT-PCR檢測(cè)JNK和GRP78 mRNA表達(dá) Trizol法抽提總RNA，測(cè)定總RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 1 min;95℃ 30 s，55℃(GAPDH)/56℃(JNK)/49 ℃(GRP78)30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)33次;72℃ 10 min。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.7 Western blotting檢測(cè) JNK、p-JNK 和 GRP78蛋白含量 將約100 mg肺組織塊置研缽中并碾碎，加800 μL單去污劑裂解液(含PMSF)于研缽中，于冰上反復(fù)碾壓使組織碾碎。取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉2 h后加入Ⅰ抗JNK、p-JNK、GRP78單克隆抗體及兔抗GAPDH多克隆IgG抗體(1∶1 000稀釋)，4℃反鋪法過夜。分別加入1∶500Ⅱ抗，室溫反應(yīng)2 h。ECL化學(xué)發(fā)光，X射線底片曝光。

3.8 原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡 按照試劑盒說明操作。細(xì)胞核中有棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡(×400)下的凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)=檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞數(shù)÷5個(gè)高倍視野檢測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)×100%。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組肺W/D、TLW和IQA的變化

與sham組相比，I/R組和I/R+DMSO組W/D、TLW及IQA均明顯升高(P＜0.01)，且I/R組和I/R+DMSO組相比，W/D、TLW和IQA無(wú)顯著差異(P＞0.05);與 I/R+DMSO組相比，I/R+Cur低、中、高劑量組W/D、TLW及IQA逐漸下降(P＜0.05或P＜0.01)，以I/R+Cur高劑量組降低明顯(P＜0.05或P ＜0.01)，見表2。

表2 各組肺組織W/D、TLW、IQA及AI的變化Table 2.Comparison of W/D，TLW，IQA and AI of lung tissues in different groups(mean±SD.n=10)

2 各組肺組織形態(tài)學(xué)變化

Sham組肺間質(zhì)及肺泡完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1A。I/R組和I/R+DMSO組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁水腫增厚或破裂，肺泡內(nèi)水腫滲出或紅細(xì)胞漏出或炎癥細(xì)胞漏出，見圖1B、C(粗箭頭示炎癥浸潤(rùn)，細(xì)箭頭示肺泡內(nèi)水腫)。I/R+Cur低、中、高各劑量組肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)較完整，肺泡內(nèi)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均有不同程度減輕，以I/R+Cur高劑量組減輕最為明顯，見圖1D、E、F。

Figure 1.Morphological changes of mouse lung tissues in various groups(×200).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.圖1 各組肺組織形態(tài)學(xué)的變化

3 各組肺組織超微結(jié)構(gòu)改變

由圖2A可見，sham組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，基底膜完整，II型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴清楚，板層小體未見改變，微絨毛無(wú)減少。I/R組和I/R+DMSO組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，基底膜有斷裂、不完整，線粒體腫脹，II型肺泡上皮細(xì)胞微絨毛脫落明顯，核固縮，胞漿內(nèi)板層小體數(shù)量減少、排空增多，肺泡隔水腫，肺泡隔及毛細(xì)血管內(nèi)炎癥細(xì)胞附壁增多，見圖2B、C(粗箭頭示板層小體，細(xì)箭頭示微絨毛)。與I/R組及I/R+DMSO組相比，隨著姜黃素劑量的逐漸增加，I/R+Cur各劑量組肺組織超微結(jié)構(gòu)損傷逐漸減輕，肺泡結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)清晰可辨，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹較輕，核染色質(zhì)較均勻;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞與鄰近結(jié)構(gòu)的界限明顯，其表面微絨毛較多，基質(zhì)中線粒體輕度腫脹，嵴較多，嗜鋨性板層不多，肺泡隔結(jié)締組織略增厚，以Cur高組最為明顯，見圖2D、E、F。

Figure 2.Ultrastructure changes of type II alveolar epithelial cells in different groups observed by electron microscopy(×10 000).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.圖2 各組肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化

4 各組JNK和GRP78 mRNA水平表達(dá)的變化

GRP78 mRNA在sham組中低表達(dá)，在其余所有組別中均明顯表達(dá)(P＜0.05);JNK mRNA在sham組中低表達(dá)，在I/R組、I/R+DMSO組和I/R+Cur各劑量組中均明顯表達(dá)(P＜0.05)，但隨著I/R+Cur劑量的增加，其表達(dá)量逐漸降低，以I/R+Cur高劑量組下降最為明顯(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The expression levels of GAPDH，GRP78 and JNK mRNA in mouse lung tissues in various groups detected by RT-PCR.A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group:E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;▲P＜0.05 vs I/R+DMSO group.圖3 各組肺組織GRP78和JNK mRNA的表達(dá)水平

5 各組JNK、p-JNK和GRP78蛋白水平表達(dá)的變化

各組肺組織均可檢測(cè)到JNK蛋白的表達(dá)，且表達(dá)量在各組間無(wú)明顯差異。p-JNK蛋白在sham組中低表達(dá)，在I/R組、I/R+DMSO組和I/R+Cur各劑量組中均明顯表達(dá)(P＜0.05)，但隨著Cur劑量的增加，其表達(dá)量逐漸降低，以I/R+Cur高劑量組下降最為明顯(P＜0.05);GRP78蛋白在sham組中低表達(dá)，在其余所有組別中均明顯高表達(dá)(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The expression levels of GAPDH，GRP78，p-JNK and JNK proteins in mouse lung tissues in various groups detected by Western blotting.A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group:E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;▲P ＜0.05 νs I/R group.圖4 Western blotting示各組肺組織GRP78和p-JNK蛋白的表達(dá)水平

6 各組肺組織細(xì)胞AI的改變

由圖5、表2可見，sham組細(xì)胞凋亡數(shù)量較少;與sham組相比，I/R組和I/R+DMSO組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，細(xì)胞凋亡以肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞為主，AI亦明顯升高(P＜0.01);I/R組與I/R+DMSO組相比，AI無(wú)顯著差異(P＞0.05);與I/R組和I/R+DMSO組相比，I/R+Cur低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡數(shù)量逐漸降低，AI亦逐漸下降(P＜0.05或P＜0.01)，以 I/R+Cur高劑量組下降最為明顯(P ＜0.01)。

Figure 5.Apoptosis of mouse lung tissues in various groups detected by TUNEL method(×400).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.圖5 各組肺組織細(xì)胞凋亡的情況

7 相關(guān)性分析結(jié)果

AI與 W/D、TLW、IQA、JNK mRNA 和 p-JNK 蛋白之間呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.787、0.768、0.898、0.873 和 0.892，均 P ＜ 0.01，n=60)，與GRP78 mRNA和蛋白之間呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為－0.306和 －0.341，均 P ＜0.05，n=60)。

討 論

本研究觀察到sham組肺組織少量細(xì)胞凋亡，I/R組和I/R+DMSO組出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡，同時(shí)肺組織受損程度的敏感指標(biāo)W/D、TLW和IQA均明顯升高，光鏡、電鏡顯示肺組織結(jié)構(gòu)明顯損傷，且肺細(xì)胞AI與W/D、TLW和IQA呈正相關(guān)關(guān)系，提示細(xì)胞凋亡參與了肺I/R損傷的發(fā)生。經(jīng)Cur干預(yù)后，肺組織細(xì)胞AI、W/D、TLW和IQA降低，肺組織結(jié)構(gòu)損傷減輕，表明Cur可能通過減輕細(xì)胞凋亡而治療肺I/R損傷，保護(hù)肺組織。

缺血缺氧、葡萄糖/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、氧化應(yīng)激及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等因素均可引起ERS［14］，研究已證實(shí)，持續(xù)過強(qiáng)的ERS將引起ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡，從而引起組織損傷。ERS需3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白——蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，Ire1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)介導(dǎo)，正常情況下，這3種蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)側(cè)都與GRP78結(jié)合而處于無(wú)活性狀態(tài)。ERS發(fā)生時(shí)，GRP78即與這3種蛋白質(zhì)解離，因此GRP78的急速上調(diào)被認(rèn)為是ERS最敏感的標(biāo)志［15］。解離的GRP78與未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)結(jié)合緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白負(fù)荷發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GRP78 mRNA和蛋白表達(dá)量在sham組很低，而肺I/R后表達(dá)明顯上調(diào)，說明肺I/R誘導(dǎo)了過度ERS的發(fā)生，同時(shí)GRP78發(fā)揮著積極的保護(hù)作用。

MAPKs是存在于細(xì)胞漿內(nèi)的一類具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)的蛋白激酶家族，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等多種生理過程，并能將多種細(xì)胞外信號(hào)通過磷酸化傳遞到細(xì)胞核中，因此MAPKs信號(hào)通路是細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn)，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPKs信號(hào)通路中重要的通路之一，在多種生理、病理的程序性細(xì)胞死亡過程中起重要的調(diào)控作用。并且JNK通路與應(yīng)激誘導(dǎo)型凋亡有關(guān)，可被多種細(xì)胞外應(yīng)激(如缺血缺氧、細(xì)胞因子、應(yīng)激等)激活而引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而損傷組織。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種臟器I/R后，存在JNK的過度激活，且抑制JNK可改善I/R損傷。因此，深入探討JNK在臟器I/R中的作用對(duì)于治療肺I/R損傷具有重要意義。嚴(yán)重ERS時(shí)，活化的Ire1與TNF受體相關(guān)因子1(TNF receptor-associated factor 1，TRAF1)相連，其復(fù)合物募集凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)將激活JNK通路，引起細(xì)胞凋亡［16］。研究表明，乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧和心肌I/R中，心肌組織細(xì)胞再灌注損傷與GPR78和JNK表達(dá)增高有關(guān)［17］，缺血后處理通過抑制JNK通路對(duì)再灌注心肌發(fā)揮保護(hù)作用［18］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，肺I/R后JNK迅速活化，JNK mRNA和p-JNK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。給予Cur預(yù)處理后，JNK mRNA表達(dá)和p-JNK蛋白表達(dá)呈劑量依賴性下調(diào)，且其表達(dá)量與細(xì)胞AI呈明顯正相關(guān)關(guān)系。上述結(jié)果提示抑制JNK凋亡途徑可能是減輕肺I/R損傷的途徑之一;Cur可能通過抑制ERS中JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過度活化來拮抗肺I/R損傷。

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