自噬溶酶體抑制劑氯化銨促進(jìn)維生素K3誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的作用*

于春艷， 劉 希， 張 鈺， 蘇 靜， 劉玉和△

維生素K3(vitamin K3，VK3)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡［1］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)維生素K3能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬［2］。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的功能［3］;而另外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示自噬是II型程序化細(xì)胞死亡的形式［4］。可見細(xì)胞自噬的作用復(fù)雜，VK3誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在腫瘤治療中的作用及其機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。因此本實(shí)驗(yàn)以He-La細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用溶酶體抑制劑氯化銨(ammonium chloride，NH4Cl)［5］觀察對(duì) VK3 處理 HeLa 細(xì)胞的溶酶體通透性、對(duì)自噬泡形成的影響，同時(shí)觀察對(duì)細(xì)胞漿pH值的影響及對(duì)VK3作用后HeLa細(xì)胞凋亡的影響，探討VK3誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中的作用。

材料和方法

1 材料

人HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)院;新生小牛血清購自 Gibco，IMDM培養(yǎng)基購自 Hy-Clone;MTT 粉末、吖啶橙(acridine orange，AO)、BCECF-AM和Hoechst 33342均購自Sigma;單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)購自 Invitrogen。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基 (10%新生牛血清，IMDM 培養(yǎng)液，pH 7.4)中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照(control)組(細(xì)胞用 IMDM 培養(yǎng));VK3(30 μmol/L)組;NH4Cl(10 mmol/L)組;VK3(30 μmol/L)+NH4Cl(10 mmol/L)組。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞以1×104cells/well接種至96孔板，每孔100 μL，每組細(xì)胞6復(fù)孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入5 g/L的MTT 20 μL。培養(yǎng)結(jié)束后，傾去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度(absorbance，A)，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用以檢測細(xì)胞活性。對(duì)照組細(xì)胞生存率為100%，其余各組生存率(%)=(各濃度組A值/對(duì)照組A值)×100%。

2.3 AO染色檢測溶酶體穩(wěn)定性 將AO加入各組細(xì)胞中，終濃度為1 μmol/L，37 ℃孵育15 min，棄去染料，用PBS洗滌3次，405 nm 激發(fā)下［6］，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

2.4 MDC染色檢測自噬泡的形成 將各組細(xì)胞爬片用含PBS的0.05 mmol/L MDC在37℃孵育60 min，孵育后的細(xì)胞用PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫下固定10 min，用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀染色為陽性表現(xiàn)［7］。

2.5 BCECF-AM檢測細(xì)胞漿pH值 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞藥物處理后，胰酶消化，分別收集各組的細(xì)胞樣品，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無血清無酚紅培養(yǎng)基洗1次。使用pH敏感的探針BCECFAM(20 μmol/L)標(biāo)記細(xì)胞，37℃下孵育細(xì)胞20 min，F(xiàn)ACScan 488 nm激發(fā)，相應(yīng)的胞內(nèi)pH值根據(jù)其熒光強(qiáng)度大小顯示于二維點(diǎn)陣圖上(X軸520 nm，Y軸640 nm)，記錄520/640發(fā)射熒光，求出該比值，該比值代表堿/酸pH值的比值，此比值低，代表pH值是酸性的。R2區(qū)域代表含有酸性pH值的細(xì)胞數(shù)［8］。

2.6 Hoechst 33342染色檢測凋亡細(xì)胞核形態(tài) 將10 mg/L Hoechst 33342加入各組細(xì)胞中，37℃孵育10 min，4% 多聚甲醛固定5～10 min后，棄去上清，用PBS洗滌，353～365 nm激發(fā)下顯示藍(lán)色熒光，激光共聚焦顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)并計(jì)算凋亡率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NH4Cl和VK3對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用NH4Cl對(duì)HeLa細(xì)胞存活率沒有影響 ［(96.6±4.3)%］。VK3組細(xì)胞生存率為(77.1±3.3)%，VK3與氯化銨共同作用組He-La細(xì)胞存活率為(53.5±4.1)%，低于VK3作用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2 AO染色檢測溶酶體通透性

AO染色共聚焦顯微鏡觀察顯示，在VK3聯(lián)合NH4Cl處理的HeLa細(xì)胞中紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，而單獨(dú)應(yīng)用VK3或NH4Cl處理細(xì)胞AO染色沒有改變，見圖1。

3 MDC檢測自噬泡的變化

MDC染色激光共聚顯微鏡觀察顯示，與對(duì)照組相比，在單獨(dú)應(yīng)用VK3作用12 h后細(xì)胞內(nèi)綠色點(diǎn)狀熒光亮度明顯增強(qiáng)，提示VK3組細(xì)胞自吞噬泡產(chǎn)生明顯增多。聯(lián)合應(yīng)用 VK3和NH4Cl與單獨(dú)應(yīng)用VK3相比，細(xì)胞內(nèi)綠色點(diǎn)狀熒光亮度增強(qiáng)更明顯，提示自噬泡的數(shù)量顯著增加，見圖2。

Figure 1.Lysosomal permeabilization analysis for acridine orange staining in HeLa cells(×400).圖1 AO染色激光共聚焦檢測HeLa細(xì)胞溶酶體通透性的變化

Figure 2.Fluorescence microscopic analysis for MDC staining in HeLa cells(×400).圖2 MDC染色檢測HeLa細(xì)胞自噬泡的變化

4 BCECF-AM檢測細(xì)胞漿酸化程度

單獨(dú)應(yīng)用VK3作用HeLa細(xì)胞，F(xiàn)L1/FL2比值降低(P ＜0.05)。聯(lián)合應(yīng)用 VK3和 NH4Cl，F(xiàn)L1/FL2比值與單獨(dú)應(yīng)用VK3相比明顯降低(P＜0.05)，見圖3。R2區(qū)域代表含有酸性pH的細(xì)胞。單獨(dú)應(yīng)用VK3，酸性pH的細(xì)胞比例為13.6%，聯(lián)合應(yīng)用VK3和NH4Cl，酸性pH的細(xì)胞比例為43.8%，提示細(xì)胞漿呈酸性，見圖4。

5 Hoechst 33342檢測NH4Cl和VK3對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)Hoechst 33342染色之后，與單獨(dú)應(yīng)用VK3［凋亡率(10.6±3.3)%］相比，聯(lián)合應(yīng)用 VK3和NH4Cl細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮濃染，核分葉狀或月牙狀，呈典型凋亡細(xì)胞的形態(tài)，凋亡率為(28.6±3.7)%，見圖5。

討 論

Figure 3.Changes of cytosolic pH induced by NH4Cl in HeLa cellsloaded with pH-sensitive fluorescentprobe BCECF-AM.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs VK3 group.圖3 BCECF-AM檢測HeLa細(xì)胞胞漿酸化程度的變化

已有報(bào)道，許多抗腫瘤藥物在發(fā)揮抗腫瘤作用時(shí)產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，而且ROS產(chǎn)生是藥物發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的必要因素［9］。某些化療藥物，例如三氧化二砷、evodiamine誘導(dǎo) U251或 HeLa細(xì)胞產(chǎn)生ROS聚積，直接作用于線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。研究發(fā)現(xiàn)，ROS 能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［4］。Zhang等［11］報(bào)道H2O2能夠引起U251細(xì)胞LC3-II蛋白水平增加及自噬泡增多，用自噬早期階段特異性抑制劑3-MA抑制自噬，降低了H2O2引起的細(xì)胞凋亡。溶酶體抑制劑氯化銨能夠增加蛇毒素Crotoxin對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒性，細(xì)胞對(duì)蛇毒素更加敏感［12］，MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，使用氯化銨后能夠使VK3誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低，提示VK3誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生的自噬可能減輕維生素K3誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

Figure 4.The proportion of cells with acidic intracellular pH detected by BCECF-AM.圖4 BCECF-AM檢測細(xì)胞漿內(nèi)酸性的細(xì)胞比例

Figure 5.Fluorescence microscopic analysis for Hoechst 33342 staining in HeLa cells treated with NH4Cl and VK3(×400).圖5 Hoechst 33342檢測NH4Cl和VK3對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

自噬是溶酶體依賴的降解途徑，是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，其中最后一個(gè)過程是自噬體與溶酶體融合，最終降解細(xì)胞漿物質(zhì)和細(xì)胞器［13］。Kawai等［14］用 bafilomycin A1、氯喹及氯化銨分別處理饑餓條件下的CHO細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)線粒體與溶酶體沒有發(fā)生共定位，結(jié)果證明溶酶體的酸性對(duì)自噬體與溶酶體融合非常必要。研究發(fā)現(xiàn)，自噬能清除神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元細(xì)胞中的蛋白聚集物及衰老的細(xì)胞中受損傷的線粒體等細(xì)胞器。饑餓［15］引起HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬或者堿性藥物temozolomide［16-17］引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，用bafilomycin A1或羥氯喹處理后，發(fā)現(xiàn)自噬體與溶酶體融合被抑制，caspase激活、線粒體膜通透性增加，自噬體內(nèi)容物長壽命蛋白的降解也減少。在順鉑耐受的人卵巢癌細(xì)胞及HeLa細(xì)胞中，順鉑激活的自噬能有效地運(yùn)輸錯(cuò)誤折疊蛋白，使腫瘤細(xì)胞避免細(xì)胞凋亡［18-19］。有研究發(fā)現(xiàn)，如果不能清除細(xì)胞內(nèi)堆積的蛋白質(zhì)，這些蛋白將對(duì)細(xì)胞具有毒性，可能引起凋亡［20］。AO實(shí)驗(yàn)及MDC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用VK3和NH4Cl后，HeLa細(xì)胞溶酶體膜通透性增高，細(xì)胞內(nèi)自噬泡大量堆積，凋亡細(xì)胞數(shù)也增多，提示NH4Cl由于增加了溶酶體通透性，阻止自噬體與溶酶體融合，促使細(xì)胞內(nèi)堆積了大量自噬泡。自噬的完整過程被破壞，不能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

TNF-α作用U937細(xì)胞時(shí)，溶酶體組織蛋白酶D從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿，應(yīng)用溶酶體去垢劑MSDH作用于U937細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)溶酶體組織蛋白酶D從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿，同時(shí)細(xì)胞漿酸化［21］。H2O2［22］或抗腫瘤藥物［23］作用白血病細(xì)胞HL60，引起細(xì)胞漿酸化，進(jìn)而促凋亡蛋白Bax轉(zhuǎn)位至線粒體，caspase-3被激活，細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞漿，發(fā)生細(xì)胞凋亡。BCECF-AM實(shí)驗(yàn)及Hoechst 33342實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用VK3和NH4Cl，F(xiàn)L1/FL2比值與單獨(dú)應(yīng)用VK3相比明顯降低，酸性細(xì)胞數(shù)比單獨(dú)應(yīng)用VK3增多，細(xì)胞漿發(fā)生酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

總之，我們的研究證明了自噬溶酶體抑制劑氯化銨干擾細(xì)胞自噬完整過程，促使對(duì)VK3誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡增多。自噬在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮了保護(hù)作用，有利于腫瘤細(xì)胞生存。聯(lián)合抑制自噬作用將有利于氧化應(yīng)激抗腫瘤治療效果。

［1］ 周 磊，李 揚(yáng)，蘇 靜，等.維生素K3對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌PC23M細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用［J］.中國病理生理雜志，2007，23(7):1339-1342.

［2］ 于春艷，李洪巖，鐘加滕，等.維生素 K3通過下調(diào)mTOR信號(hào)途徑而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(9):1173-1176.

［3］ Azad MB，Chen Y，Gibson SB.Regulation of autophagy by reactive oxygen species(ROS):implications for cancer progression and treatment［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11(4):777-790.

［4］ Ye LH，Li WJ，Jiang XQ，et al.Study on the autophagy of prostate cancer PC-3 cells induced by oridonin ［J］.Anat Rec(Hoboken)，2012，295(3):417-422.

［5］ Mizushima N，Yoshimori T，Levine B.Methods in mammalian autophagy research［J］.Cell，2010，140(3):313-326.

［6］ Xu Y，Zheng H，Kang JS，et al.5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid induced drug resistance to cisplatin in human erythroleukemia cell lines［J］.Anat Rec(Hoboken)，2011，294(6):945-952.

［7］ 孔曉霞，張宏宇，鐘加滕，等.自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞損傷中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(4):695-698.

［8］ De Milito A，Iessi E，Logozzi M，et al.Proton pump inhibitors induce apoptosis of human B-cell tumors through a caspase-independent mechanism involving reactive oxygen species［J］.Cancer Res，2007，67(11):5408-5417.

［9］ Essick EE，Sam F.Oxidative stress and autophagy in cardiac disease，neurological disorders，aging and cancer［J］.Oxid Med Cell Longev，2010，3(3):168-177.

［10］ Yang J，Wu LJ，Tashino S，et al.Reactive oxygen species and nitric oxide regulate mitochondria-dependent apoptosis and autophagy in evodiamine-treated human cervix carcinoma HeLa cells［J］.Free Radic Res，2008，42(5):492-504.

［11］ Zhang H，Kong X，Kang J，et al.Oxidative stress induces parallel autophagy and mitochondria dysfunction in human glioma U251 cells［J］.Toxicol Sci，2009，110(2):376-388.

［12］ Yan CH，Liang ZQ，Gu ZL，et al.Contributions of autophagic and apoptotic mechanisms to CrTX-induced death of K562 cells［J］.Toxicon，2006，47(5):521-530.

［13］尤壽江，石際俊，張艷林，等.ROS介導(dǎo)的自噬及其在相關(guān)疾病中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(1):187-190.

［14］ Kawai A，Uchiyama H，Takano S，et al.Autophagosomelysosome fusion depends on the pH in acidic compartments in CHO cells［J］.Autophagy，2007，3(2):154-157.

［15］ Boya P，Gonzalez-Polo RA，Casares N，et al.Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis［J］.Mol Cell Biol，2005，25(3):1025-1040.

［16］ Natsumeda M，Aoki H，Miyahara H，et al.Induction of autophagy in temozolomide treated malignant gliomas［J］.Neuropathology，2011，31(5):486-493.

［17］ Shingu T，F(xiàn)ujiwara K，Bogler O，et al.Inhibition of autophagy at a late stage enhances imatinib-induced cytotoxicity in human malignant glioma cells ［J］.Int J Cancer，2009，124(5):1060-1071.

［18］ Yu H，Su J，Xu Y，et al.p62/SQSTM1 involved in cisplatin resistance in human ovarian cancer cells by clearing ubiquitinated proteins ［J］.Eur J Cancer，2011，47(10):1585-1594.

［19］Xu Y，Yu H，Qin H，et al.Inhibition of autophagy enhances cisplatin cytotoxicity through endoplasmic reticulum stress in human cervical cancer cells［J］.Cancer Lett，2012，314(2):232-243.

［20］ Fink AL.Protein aggregation:folding aggregates，inclusion bodies and amyloid［J］.Fold Des，1998，3(1):R9-R23.

［21］ Nilsson C，Johansson U，Johansson AC，et al.Cytosolic acidification and lysosomal alkalinization during TNF-α induced apoptosis in U937 cells［J］.Apoptosis，2006，11(7):1149-1159.

［22］ Ahmad KA，Iskandar KB，Hirpara JL，et al.Hydrogen peroxide-mediated cytosolic acidification is a signal for mitochondrial translocation of bax during drug-induced apoptosis of tumor cells［J］.Cancer Res，2004，64(21):7867-7878.

［23］ Hirpara JL，Clément MV，Pervaiz S.Intracellular acidification triggered by mitochondrial-derived hydrogen peroxide is an effector mechanism for drug-induced apoptosis in tumor cells［J］.J Biol Chem，2001，276(1):514-521.