紅藻氨酸誘導PC12細胞凋亡及阿魏酸對神經(jīng)元的保護作用*

陳 勤， 葉海燕， 陳逸青， 余嗣明

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為學習記憶障礙和認知能力的喪失。AD患者尸解發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)神經(jīng)細胞出現(xiàn)大量凋亡(apoptosis)，并伴有神經(jīng)元胞外老年斑(senile plaque，SP)沉積和胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)?，F(xiàn)已知，AD神經(jīng)元凋亡主要是由于β淀粉樣蛋白(amyloid betaprotein，Aβ)、自由基、興奮性氨基酸、神經(jīng)毒素、Ca2+超載、炎癥等有害因子的共同作用所致。近年來，興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAAs)和老年癡呆發(fā)病以及學習記憶的密切關系已引起重視。許多證據(jù)表明EAA的神經(jīng)毒性作用，尤其是異常升高的谷氨酸(glutamic acid，Glu)在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中起著極為重要的作用。谷氨酸是人腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸，正常情況下，谷氨酸參與多種生理功能，但過量的谷氨酸可引起神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載、氧化應激、線粒體功能障礙、細胞骨架崩解等而造成神經(jīng)元的損傷［1-2］。紅藻氨酸(kainic acid，KA)是Glu的類似物，可選擇性作用于腦內(nèi)的突觸前KA受體，刺激Glu的釋放并抑制其再攝取，造成神經(jīng)細胞過度興奮而凋亡［3］。阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是當歸、川芎等中藥的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和改善學習記憶等藥理活性［4-6］，阿魏酸鈉注射液是國家一類新藥，臨床上主要用于動脈粥樣硬化、冠心病、腦血管病、腎小球疾病、肺動脈高壓、糖尿病性血管病變、脈管炎、偏頭痛和血管性頭痛的治療。但有關FA能否具有降低KA誘導PC12細胞的神經(jīng)毒性和神經(jīng)元的保護作用?尚未見報道。本文采用KA誘導PC12細胞凋亡來觀察細胞的活力及相關凋亡基因bcl-2、bax和細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)表達的變化，旨在揭示阿魏酸抑制AD神經(jīng)元凋亡的作用機制。

材料和方法

1 材料

1.1 藥品、細胞株與試劑 KA、四甲基偶氮唑藍(MTT)、DMSO和多聚賴氨酸(70～150 kD)均購自Sigma;FA購自中國藥品生物制品檢定所;低分化型PC12細胞株購自中科院細胞庫;DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自HyClone;Bcl-2、Bax和Cyt C多克隆抗體均購自Santa Cruz;山羊血清、DAB顯色試劑盒和SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;annexin V-FITC凋亡試劑盒購自南京凱基生物有限公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品;化學發(fā)光試劑為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 2123-2型SHELLAB CO2培養(yǎng)箱(Sheldon);BX41熒光顯微鏡(帶DP70攝像系統(tǒng))(Olympus);450型酶標儀(Bio-Rad);EPIC XL-MCL型流式細胞儀(Beckman Coulter);24孔、96孔培養(yǎng)板(Corning)。5417型臺式冷凍離心機(Eppendorf);DYCZ-24DN型、迷你雙垂直電泳槽和DYCZ-40D型半干式轉移電泳槽均為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) PC12細胞株用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2濃度和飽和濕度，待細胞長至80%豐度后用0.25%胰酶消化傳代l次(約2～3 d)，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，實驗時取對數(shù)生長期細胞進行實驗。進行MTT實驗前，將細胞接種到96孔培養(yǎng)板用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);流式細胞儀檢測前，將細胞接種至6孔培養(yǎng)板用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng);免疫組化實驗均用24孔培養(yǎng)板爬片法培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。

2.2 實驗分組及藥物干預 當培養(yǎng)的細胞處于對數(shù)生長時，將細胞分為5組:(1)正常對照組:不加任何處理因素，換上同體積新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基;(2)KA模型組:在培養(yǎng)液中加入終濃度為50 μmol/L KA;(3)FA低、中、高劑量組:在培養(yǎng)液中，加入 50 μmol/L KA 和 25、50 和 100 μmol/L FA。細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后進行各項指標檢測。

2.3 MTT法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期的PC12細胞，用0.125%胰蛋白酶消化后調(diào)節(jié)密度為1×108/L接種于96孔板中，每孔加入100 μL，無血清培養(yǎng)24 h，然后按照上述分組方法進行藥物干預，每組設置6個復孔，24 h后，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后取出96孔培養(yǎng)板，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上振蕩10 min，待紫色結晶完全溶解后用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光度(absorbance，A)。以只加培養(yǎng)液的孔為調(diào)零參照，細胞活力用百分比表達，視對照組的細胞活性為100%。結果計算:細胞存活率(%)=實驗組A490/對照組A490×100%。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的PC12細胞，用0.125%胰蛋白酶消化后調(diào)節(jié)密度為1×108/L接種于96孔板中，每孔2 mL，無血清培養(yǎng)24 h按照上述分組方法進行藥物干預，每組設置6個復孔，24 h后，用細胞凋亡檢測試劑盒內(nèi)的緩沖液300 μL重懸，加入5 μL annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻室溫避光反應10 min，最后在1 h內(nèi)進行流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。在流式細胞儀的散點圖上，左下象限表示為活細胞(annexin V-/PI-)，右下象限表示為早期凋亡細胞(annexin V+/PI-)，右上象限表示為晚期凋亡細胞(annexin V+/PI+)，左上象限表示為壞死細胞(annexin V-/PI+)。

2.5 免疫細胞化學檢測Bcl-2、Bax和Cyt C的表達將蓋玻片置于24孔板中，分組與藥物處理同上。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3次，每次5 min;每片加3%H2O2甲醇溶液200 μL，室溫 10 min，PBS 浸洗 3次，每次5 min;小心取出蓋玻片晾干，隨機抽樣，分3批，備用。實驗時在切片滴加5%山羊血清30 μL，37℃濕盒中孵育20 min封閉;吸去封閉液(勿洗);滴加配好的Ⅰ抗 Bcl-2或 Bax或 Cyt C應用液(1∶100)30 μL，4 ℃ 濕盒孵育過夜;PBS 洗 5 min ×3次;滴加生物素標記的羊抗兔 IgGⅡ抗(1∶60)30 μL，于37 ℃濕盒孵育1.5 h;PBS洗5 min×3次;每片滴加 SABC 30 μL，于37℃濕盒孵育30 min;PBS洗5 min×3次;DAB顯色，蘇木精復染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后鏡檢與拍片。以PBS置換Ⅰ抗作為陰性對照，實驗中每批細胞片做1張陰性對照。光鏡以胞漿被染為棕黃色或棕紅色的細胞記為陽性細胞，在高倍視野(×400)下每張細胞片隨機選取4個非重疊視野對各組Bax、Bcl-2和Cyt C反應陽性的細胞進行計數(shù)，計算占所有細胞的百分率。

2.6 Western bloting檢測Bcl-2、Bax和 Cyt C 的表達水平 提取各組PC12細胞中的蛋白樣品，用BCA試劑盒進行蛋白定量。取適量樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液混勻，在100℃沸水中煮5 min，各組取15 μg樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(5%濃縮膠、12%分離膠)電泳分離，先用100 V電泳待溴酚藍至濃縮膠底后改用120 V電泳，當溴酚藍距離分離膠底1 cm時停止電泳。分離的蛋白在250 mA條件下轉膜150 min，將目的蛋白轉移到NC膜上，用TBST洗膜，室溫下用新配的5%脫脂奶粉封閉作用3 h，TBST洗膜后分別加入TBST稀釋的Ⅰ抗［β-actin(1∶1 000)、Bax(1∶300)、Bcl-2(1∶500)和 Cyt C(1∶500)］4 ℃過夜;TBST洗滌3×20 min，加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌2×20 min，用化學發(fā)光劑避光反應3 min，將NC膜在暗室中曝光。以β-actin作為內(nèi)參照，統(tǒng)計各組蛋白與β-actin A值的比值。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用單因素方差(One-way ANOVA)分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 阿魏酸對KA誘導的PC12細胞存活率的影響

由表1可見，KA處理組存活率僅為44.38%，與正常對照組相比差異顯著(P＜0.01)，而FA處理組(25、50 和 100 μmol/L)存活率依次為 60.29%、72.26%和81.65%，與KA處理組相比差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)，并隨著劑量的增加，有明顯的量效關系，提示FA對KA誘導的PC12細胞活力降低具有較好的保護作用。

2 阿魏酸對KA誘導的PC12細胞凋亡率的影響

由流式細胞術散點圖可知，正常組細胞凋亡率為3.65%，KA處理后凋亡率顯著上升(56.21%)，而采用FA處理細胞后，25、50和100 μmol/L組細胞凋亡率分別為 34.90%、25.34%和 13.27%，表明FA可以明顯抑制KA誘導的細胞凋亡，而且這種抑制作用與FA的劑量呈明顯的量效關系，見圖1和表1。

3 阿魏酸對KA誘導的PC12細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Cyt C表達的影響

3.1 免疫細胞化學法 與正常對照組相比，KA模型組Bcl-2陽性細胞數(shù)較少，而Bax和Cyt C陽性細胞數(shù)量明顯增多，Bcl-2/Bax比值下降;經(jīng)FA干預后，3個劑量組細胞中Bcl-2陽性率明顯增加，而Bax和Cyt C陽性率顯著減少，且Bcl-2/Bax比值上升明顯，見圖2和表2。3.2 Western blotting 圖3顯示，與正常對照組相比，KA模型組 PC12細胞 Bcl-2表達下調(diào) (P＜0.01)，而 Bax和 Cyt C表達顯著升高 (均 P＜0.01)。經(jīng)FA 處理后，25、50 和100 μmol/L FA 組細胞中Bcl-2表達量明顯升高，而Bax和Cyt C表達量顯著減少，與KA模型組比較，差異顯著(P＜0.05或 P ＜0.01)。

表1 阿魏酸對KA誘導PC12細胞存活率和凋亡率的影響Table 1.Effects of FA on the viability and apoptotic rate of PC12 cells induced by KA(mean±SD.n=10)

Figure 1.Effect of FA on the apoptotic rate of PC12 cells induced by KA.A:normal control group;B:KA(50 μmol/L)group;C ～ E:KA(50 μmol/L)+FA(25，50 and 100 μmol/L)groups.圖1 阿魏酸對KA誘導的PC12細胞凋亡率的影響

Figure 2.Effect of FA on the expression of Bax in PC12 cells induced by KA(immunocytochemical staining，×400).A:normal control group;B:KA(50 μmol/L)group;C ～ E:KA(50 μmol/L)+FA(25，50 and 100 μmol/L)groups.→:positive cells.圖2 阿魏酸對KA誘導的PC12細胞Bax表達的影響

表2 阿魏酸對KA誘導PC12細胞Bcl-2、Bax和Cyt C表達的影響Table 2.Effects of FA on the expression of Bcl-2，Bax and Cyt C in PC12 cells induced by KA(mean±SD.n=10)

Figure 3.Effects of FA on the expression levels of Bcl-2，Bax and Cyt C in PC12 cells induced by KA.1:normal control group;2:KA(50 μmol/L)group;3 ～5:KA(50 μmol/L)+FA(25，50 and 100 μmol/L)groups.Mean ± SD.n=3.##P ＜ 0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖3 阿魏酸對KA誘導的PC12細胞Bcl-2、Bax和Cyt C表達量的影響

討 論

大量的動物實驗與臨床研究表明，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡速度與其學習記憶功能減退的病程有密切的關系。以往對其機制的研究主要集中在Aβ在腦內(nèi)的異常沉積對神經(jīng)元的毒性方面，但近年來隨著分子生物學的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)AD患者大腦海馬區(qū)興奮性氨基酸濃度的異常升高可誘發(fā)大量神經(jīng)細胞凋亡，因此興奮性氨基酸及其受體抑制劑已成為目前研究與開發(fā)新藥的靶點。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質，與突觸發(fā)生、神經(jīng)變性、神經(jīng)毒性等諸多生理、病理過程密切相關。在正常情況下，Glu具有長時程增強、神經(jīng)可塑性等特征，在神經(jīng)元和膠質細胞的增殖、存活與凋亡、學習和記憶、突觸發(fā)生、突觸傳遞效率和信號轉導等方面發(fā)揮重要作用，但Glu分泌過量反而能造成神經(jīng)元中毒(又稱為興奮性毒素)而凋亡，與癲癇、老年性癡呆和帕金森氏病等的發(fā)生有關［7-10］，有研究表明，AD老年斑中的Aβ與Glu攝取與釋放(自穩(wěn)態(tài))、NMDA受體結合等存在相互關系［11］。KA是一種興奮性氨基酸，常用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)的化學損傷劑，它特異性作用于神經(jīng)元突觸末梢的非NMDA類KA受體，刺激突觸前膜Glu的釋放并抑制突觸后膜Glu轉運蛋白再攝取，使得腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)細胞中Glu濃度持續(xù)維持在高水平，同時激活星形膠質細胞釋放大量的自由基、細胞因子和炎癥介質等有害物質和抑制其對Glu的回收，進一步加重神經(jīng)元損傷，從而引起細胞凋亡［12-18］。所以 KA的神經(jīng)興奮毒性作用可能是KA本身和內(nèi)源性谷氨酸遞質共同作用的結果。本實驗發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的PC12細胞中加入50 μmol/L KA作用24 h后，可見細胞存活率僅為44.38%，而細胞凋亡率上升到56.21%，與空白對照組相比差異顯著(P＜0.01)，通過對凋亡基因蛋白進行免疫細胞化學檢測顯示，KA可抑制抗凋亡基因bcl-2的表達，而使促凋亡基因bax的表達升高，且降低Bcl-2/Bax比值，可見KA誘導神經(jīng)細胞凋亡可能是通過Bcl-2家族而介導的。

Cyt C是線粒體呼吸鏈中的一個基本成分，除了參與電子傳遞外，也可作為凋亡起始因子在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)KA作用PC12細胞24 h后，即可使細胞內(nèi)Cyt C的表達量升高，與正常對照組比較差異極顯著。當采用阿魏酸(25、50和100 μmol/L)干預處理后，PC12細胞的存活率明顯升高，細胞凋亡率隨之下降，胞內(nèi)的Bcl-2表達升高，Bax表達下降，于此同時Cyt C表達也隨之下降。由此我們認為，KA誘導神經(jīng)細胞凋亡的機制可能是下調(diào)抗凋亡基因蛋白Bcl-2，上調(diào)促凋亡基因蛋白Bax的表達，后者在線粒體上易位，最終導致Cyt C從線粒體膜間隙滲漏到細胞質內(nèi)［19］，與凋亡蛋白酶激活因子 1(apoptotic protease-activating factor 1，Apaf-1)結合，進而激活caspase-9和caspase-3啟動凋亡級聯(lián)反應。阿魏酸抗細胞凋亡的作用機制可能是通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白的表達，提高 Bcl-2/Bax的比值，抑制Bax二聚體的形成，防止Cyt C外漏，保護線粒體結構，從而抑制神經(jīng)元的凋亡。

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