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      肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

      2013-11-06 05:08:44許蘭嬌陶清松黃志海瞿明仁何后軍
      關(guān)鍵詞:體病肉牛紅細(xì)胞

      許蘭嬌,陶清松,黃志海,,瞿明仁,何后軍,萬 根*

      (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,江西 南昌 330045;2.江西省宜春市畜牧科學(xué)研究所,江西 宜春 336000)

      肉牛附紅細(xì)胞體病是由溫氏附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon wenyonii)寄生于肉牛紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓等部位引起的一種人畜共患傳染病,臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、貧血、黃疸為主。自 Schiling等[1]首次報(bào)道附紅細(xì)胞體病以來,該病已遍布了30多個(gè)國家和地區(qū),目前中國大部分的地區(qū)都有動(dòng)物感染該病的報(bào)道[2]。

      肉牛附紅細(xì)胞體病的發(fā)生與飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)密度、欄舍空氣質(zhì)量、環(huán)境變化、氣候變化等密切相關(guān),多數(shù)情況下,溫氏附紅細(xì)胞體侵入機(jī)體呈隱性狀態(tài),任何因素引起機(jī)體抵抗力下降時(shí),都會(huì)導(dǎo)致該病的發(fā)生[3]。近年來,中國肉牛產(chǎn)業(yè)在國家政策的指導(dǎo)下發(fā)展迅速,規(guī)模養(yǎng)牛場迅速增多,該病的報(bào)道也逐漸增多,如何防控人畜共患病的發(fā)生,促進(jìn)肉牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和消費(fèi)者的放心消費(fèi),對(duì)肉牛附紅細(xì)胞體病進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的監(jiān)測是非常必要的。

      目前,對(duì)附紅細(xì)胞體的臨床檢測仍然以鏡檢法為主,快速簡單,但是這種方法的缺點(diǎn)是特異性和敏感性低[4],容易引起假陽性和假陰性[5],導(dǎo)致臨床診斷失敗,附紅細(xì)胞體ELISA檢測試劑盒處于研發(fā)過程中,DNA探針技術(shù)、電鏡檢測等因試驗(yàn)條件或費(fèi)用昂貴等都不適合與臨床疾病診斷[6]。本試驗(yàn)通過建立一個(gè)簡單、快速、特異性好、敏感度高的肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法,對(duì)該病原的檢測做出快速準(zhǔn)確的判斷,有利于臨床上及時(shí)做出準(zhǔn)確的診斷。

      1 材料與方法

      1.1 臨床病料與處理

      肉牛附紅細(xì)胞體DNA由江西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供,陽性病料為江西省的某規(guī)模肉牛養(yǎng)殖廠無菌采集的5份附紅細(xì)胞體陽性血液樣品,加38 g/L的枸櫞酸鈉溶液抗凝,低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。

      1.2 分子生物試劑

      DNA PCR擴(kuò)增試劑盒,飽和酚、胃蛋白酶K、EB等購自大連寶生物公司,氯仿、無水乙醇、異戊醇、醋酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?,購自于江西碧源生物科技有限公司,DNA Marker DL1000購自大連寶生物公司。

      1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

      根據(jù)GenBank中已發(fā)表的肉牛溫氏附紅細(xì)胞體的16S rRNA基因序列(序列號(hào):AY946266),同時(shí)參考有關(guān)文獻(xiàn),利用計(jì)算機(jī)輔助軟件primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性PCR引物,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長為412 bp。引物序列如下:

      上游引物P1:5'-GATGGAGATCGCCTCCCTAG -3'

      下游引物P2:5'-GCACCACCTGTCTTACTGATT -3'

      引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,稀釋成濃度為20 μmol/L,-20℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.4 DNA 的提取

      按照試劑盒操作說明提取肉牛附紅細(xì)胞體 DNA,加入20μL滅菌雙蒸水或TE溶液溶解,-20℃保存?zhèn)溆没蛄⒓词褂谩?/p>

      1.5 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

      PCR 反應(yīng)總體積為25 μL,組成如下:10 × PCR buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCl21.5 μL,dNTP mixture 0.5 μL,DNA 模板 2 μL,上游引物(P1)、下游引物(P2)各1 μL,Taq 酶0.5μL,雙蒸水16μL,將各組分混勻后進(jìn)入PCR循環(huán)。擴(kuò)增基因片段的參數(shù)設(shè)置為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性58 s,58℃退火45 s,72℃延伸40 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃再延伸10 min,反應(yīng)在基因擴(kuò)增儀(PE9700)上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物,4℃保存。

      圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplified results by PCR

      圖2 特異性試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplified results by PCR in Specific Test

      圖3 敏感性試驗(yàn)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The amplified results by PCR in Sensitivity Test

      2 結(jié)果分析

      2.1 檢測結(jié)果

      取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察,可見用優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增出了412 bp的核酸條帶,結(jié)果如圖1。

      2.2 擴(kuò)增片段的特異性鑒定

      對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序,基因序列全長為412 bp,并對(duì)其序列進(jìn)行同源性分析,與Genbank中溫氏附紅細(xì)胞體(序列號(hào):FJ375309)的同源性為98%以上。提取牛大腸桿菌、弓形體、胸膜肺炎放線桿菌DNA,用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增,顯示為陰性(圖2),說明擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的特異性,用本試驗(yàn)建立的方法進(jìn)行臨床組織病料中附紅細(xì)胞體的檢測是可行的。

      2.3 敏感性試驗(yàn)

      用紫外分光光度計(jì)測定稀釋后的DNA的濃度為123 ng/μL,進(jìn)行10倍的連續(xù)稀釋,用上述PCR方法擴(kuò)增,結(jié)果顯示該P(yáng)CR方法可以檢測的最低DNA濃度為1.23 ng/μL(圖3)。

      3 討論

      (1)肉牛附紅細(xì)胞體病是一種人畜共患病,它不僅危害動(dòng)物的健康,引起動(dòng)物發(fā)生疾病和死亡,給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,而且嚴(yán)重危害人類的健康。附紅細(xì)胞體的傳播途徑多,可通過血液昆蟲(如:蚊子、蒼蠅、蜱等)、傷口、注射器等感染動(dòng)物和人[7]。近年來,人感染附紅細(xì)胞體的報(bào)道不斷增多,并呈現(xiàn)上升的趨勢,已引起醫(yī)學(xué)界和畜牧工作者的高度關(guān)注[8-12]。由于診斷方法的局限性,一些流行病學(xué)特點(diǎn)難以觀察和掌握,因此用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)肉牛附紅細(xì)胞體病進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測,對(duì)提高該病診斷的準(zhǔn)確性具有重大意義。

      (2)中國肉牛產(chǎn)業(yè)正處于一個(gè)蓬勃發(fā)展階段,對(duì)肉牛各種流行疾病做出快速準(zhǔn)確的判斷,有利于產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展。目前國內(nèi)對(duì)附紅細(xì)胞體的診斷方法主要以鏡檢法和血涂片法為主,而該方法在操作過程中常常會(huì)引起紅細(xì)胞的變形而導(dǎo)致誤診[13-14]。本試驗(yàn)建立的肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法的擴(kuò)增產(chǎn)物序列與Genbank中公布的牛溫氏附紅細(xì)胞體的序列比較,同源性98%;通過提取牛大腸桿菌、弓形體、胸膜肺炎放線桿菌的DNA并進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果均為陰性;能夠檢測的最低DNA濃度為1.23 ng/μL。說明本試驗(yàn)所建立的PCR方法具有良好的特異性和敏感性。通過對(duì)陽性血樣的檢測,結(jié)果準(zhǔn)確性良好,表明所建立的PCR方法在臨床上對(duì)肉牛附紅細(xì)胞體病能做出快速準(zhǔn)確的判斷。

      (3)國外研究人員對(duì)附紅細(xì)胞體分子生物學(xué)方面的研究較早[15]。國內(nèi)關(guān)于牛附紅細(xì)胞體分子生物學(xué)方面的研究近年來也有報(bào)道,重點(diǎn)傾向于牛附紅細(xì)胞體的鑒定歸類[16],肉牛附紅細(xì)胞體病原的PCR檢測方法未見報(bào)道。當(dāng)前,中國肉牛產(chǎn)業(yè)處于快速發(fā)展時(shí)期,做好肉牛的人畜共患病的監(jiān)測與防控,為市場提供安全放心牛肉具有重大意義。本試驗(yàn)建立的肉牛附紅細(xì)胞體PCR檢測方法操作簡單快速、特異性好、敏感度高,8 h之內(nèi)可得出結(jié)果,克服了以往方法的缺點(diǎn),為該人畜共患病的臨床監(jiān)測和診斷提供了新的分子生物學(xué)診斷技術(shù),也符合當(dāng)前人畜共患病快速診斷的需求,同時(shí)也極大地豐富了附紅細(xì)胞體的流行病學(xué)及獸醫(yī)臨床診斷學(xué)等方面的知識(shí)內(nèi)容。

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