培養(yǎng)條件對(duì)仙鶴草愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及總黃酮含量的影響

周祿斌，連芳青

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與藝術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

仙鶴草為薔薇科植物龍芽草(Agrimonia pilosa Ledeb.)的干燥地上部分。龍芽草始載于《滇南本草》，又稱仙鶴草、金頂龍芽、脫力草、狼芽草;其根芽為鶴草芽。仙鶴草性平，味苦、澀，歸心、肝經(jīng)，有收澀止血，截瘧，止痢，解毒之功效。用于咯血，吐血，崩漏下血，瘧疾，血痢，脫力勞傷，癰腫瘡毒，陰癢帶下［1］?，F(xiàn)代醫(yī)藥研究，仙鶴草中含有仙鶴草素、仙鶴草內(nèi)酯、鞣質(zhì)、鶴草酚等酚類化合物和黃酮類等化合物，具抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、降血壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用［2－3］。另外，仙鶴草還是我國(guó)常用的野菜［4］，在中藥獸藥方面也發(fā)揮著重要作用［5］。隨著仙鶴草研究的深入，使用量逐步增加，野生藥材及傳統(tǒng)的栽培方式將不能滿足其需要，因此，通過植物組織培養(yǎng)提取有效成分無疑是行之有效的解決辦法［6］。

近年來，用組織或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行藥用植物次生代謝產(chǎn)物(有效成分)的生產(chǎn)取得了很大進(jìn)展，特別是人參、紫草、紅豆杉等幾種藥用植物的細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)的方法，以愈傷組織產(chǎn)量和總黃酮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)仙鶴草愈傷組織誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化篩選，比較不同的理化因子對(duì)仙鶴草愈傷組織生長(zhǎng)的影響，篩選出仙鶴草愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及高含量總黃酮的最佳培養(yǎng)條件，為工業(yè)化生產(chǎn)仙鶴草總黃酮類化合物提供參考及高含量總黃酮體細(xì)胞無性系的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生仙鶴草瘦果采于本校植物標(biāo)本園。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的獲得 收集仙鶴草成熟果實(shí)，取出種子。挑選出健康、飽滿的種子，分成兩組。然后，以體積分?jǐn)?shù)為75%酒精10 s，升汞2 min對(duì)兩組種子進(jìn)行消毒處理。接種于MS基本培養(yǎng)基中，自然光照，(25±1)℃條件下培養(yǎng)，觀察發(fā)芽情況。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 待幼苗抽出第一片真葉時(shí)，選擇生長(zhǎng)良好的無菌幼苗子葉，并將各子葉對(duì)半切開。將所有子葉分別隨機(jī)地接入配置好的無菌培養(yǎng)基中(表1，瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L)，每瓶培養(yǎng)基接2個(gè)半片，一片正面(向陽面，下同)朝上，一片正面朝下。各實(shí)驗(yàn)號(hào)重復(fù)24瓶。于(25±1)℃條件下，遮光培養(yǎng)。一個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基各因素水平Tab.1 Factors and levers for callus induce

1.2.3 愈傷組織的增殖 選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織隨機(jī)地接入各增殖培養(yǎng)基中(表2，瓊脂7 g/L，pH 6.0，蔗糖30 g/L)。各實(shí)驗(yàn)號(hào)重復(fù)20瓶，于(25±1)℃條件下遮光培養(yǎng)，一個(gè)月后，觀察愈傷組織增長(zhǎng)情況。

1.2.4 愈傷組織總黃酮含量的測(cè)定 對(duì)各增殖的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)2次，每次培養(yǎng)40 d，繼代培養(yǎng)基與增殖培養(yǎng)基保持一致。然后，將增長(zhǎng)量較大的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)中的愈傷組織取出，用蒸餾水洗去培養(yǎng)基及壞死部分，烘干?？傸S酮含量測(cè)定方法參照方桂珍，孫曉軼等［7］進(jìn)行，以實(shí)驗(yàn)組為參比 ，采用紫外分光光度法，在510 nm處測(cè)定相對(duì)吸光度。各稱取1.5 g，按液料比10∶1量取體積分?jǐn)?shù)40%乙醇液，混于圓底燒瓶中，置于70℃水浴鍋中回流0.5 h后，過濾。將濾渣再次按同樣的方法連續(xù)回流2次，每次0.5 h，合并濾液，濃縮，即得總黃酮提取液。精密量取提取液1 mL，加入體積分?jǐn)?shù)30%乙醇4 mL，再加入5 mg/mL亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入5%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，用水定容至10 mL，搖勻，放置15 min。置比色皿中，用UV755B分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.3 計(jì)算方法

實(shí)驗(yàn)采用了5因素、5水平的L25(56)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析愈傷組織誘導(dǎo)影響;采用3因素，3水平的L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析增殖影響。統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS15.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

子葉接種后10 d，正面朝下接的子葉傷口處開始膨脹。兩周左右，出現(xiàn)淡黃色愈傷組織。對(duì)兩種接種方式的子葉觀察統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，正面朝下接的方式長(zhǎng)出愈傷組織在時(shí)間上比正面朝上接的要提前4～6 d，且總的誘導(dǎo)出愈傷組織的比例也要高。在誘導(dǎo)的過程中，發(fā)現(xiàn)子葉有向反面卷曲的趨勢(shì)，這一點(diǎn)在用葉片做外植體時(shí)表現(xiàn)的尤為明顯(圖1)。

圖1 葉片不同接入方式的愈傷組織誘導(dǎo)Fig.1 Callus induce in both blade inoculate method

2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

愈傷組織的誘導(dǎo)受培養(yǎng)條件的影響。一個(gè)月后，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表3)。結(jié)果表明，各因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響中，以6－BA影響最大，NAA其次。而2，4－D、pH及大量元素的影響均較小。方差分析結(jié)果(表4)同樣表明，6－BA和NAA兩因素水平間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。LSD多重比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)于6－BA，水平2、3、4間，誘導(dǎo)率沒有顯著性差異，但要顯著高于1、5水平;對(duì)于NAA，水平1、2、3、4間，誘導(dǎo)率沒有顯著性差異，但要顯著高于5水平。結(jié)合愈傷組織的誘導(dǎo)量考慮，最終確認(rèn)仙鶴草愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:1/2MS+6 －BA 1.0(mg/L)+NAA 0.5(mg/L)，pH 6.0 ～6.5。

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織增殖的影響

30 d后，根據(jù)各實(shí)驗(yàn)號(hào)中愈傷組織增長(zhǎng)量，統(tǒng)計(jì)分析如表5、表6。方差分析結(jié)果顯示大量元素項(xiàng)P=0.034＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明大量元素各水平間有差異，其余兩個(gè)因素沒有顯著性差異。由表5可以得出，愈傷組織增殖最優(yōu)方案為A2B3C1，但在9次實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中5、6、9這3個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)均出現(xiàn)最高長(zhǎng)勢(shì)(圖2)，這說明分析出的最佳方案是比較符合實(shí)際的。同時(shí)，鑒于經(jīng)濟(jì)因素，愈傷組織增殖最佳培養(yǎng)基定為:1/2MS+6 －BA 2.0(mg/L)+NAA 1.0(mg/L)，pH 6.0，蔗糖 30 g/L。

2.4 愈傷組織總黃酮含量的測(cè)定

取長(zhǎng)勢(shì)最好的5、6、9這3個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)中所有重復(fù)的愈傷組織進(jìn)行總黃酮的提取。在510 nm波長(zhǎng)下，測(cè)量各組相對(duì)吸收。以一組為參比，測(cè)量另外兩組相對(duì)吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)實(shí)驗(yàn)號(hào)中的吸光度以6號(hào)最低，總黃酮含量依次為5號(hào)＞9號(hào)＞6號(hào)。即在1/2MS+6－BA 2.0(mg/L)+NAA 1.0(mg/L)，pH 6.0，蔗糖30 g/L培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的愈傷組織所含總黃酮量最多，與最佳增殖培養(yǎng)條件一致。

3 討論

(1)不同接種方式對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的影響。薛建平等［8］以亳菊、貢菊、滁菊脫毒苗葉片為外植體，發(fā)現(xiàn)葉片背面接入誘導(dǎo)植株再生明顯優(yōu)于正面接入;但趙妮等［9］以君子蘭葉片為材料，發(fā)現(xiàn)葉片采用正面向下的接種方式，在延長(zhǎng)葉片的培養(yǎng)時(shí)間、防止“褐變”的發(fā)生方面明顯優(yōu)于其他接入方

式。也有認(rèn)為葉片正面接入與反面接入無明顯差異，如王建湘［10］的草莓組織培養(yǎng)。正接與反接的影響，得出結(jié)果不盡相同，可能與外植體本身有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)子葉采用兩種不同接種方式，表現(xiàn)為子葉正面朝下比正面朝上接入更易誘導(dǎo)出愈傷組織。在誘導(dǎo)的過程中，發(fā)現(xiàn)子葉有向反面卷曲的趨勢(shì)，這一點(diǎn)在用葉片做外植體時(shí)表現(xiàn)的尤為明顯，如圖2。正面朝下接，葉片向上反卷。為避免葉片因卷曲而與培養(yǎng)基脫離，接種時(shí)，建議將葉片中央劃破，這樣可使得培養(yǎng)基更易被吸收。

表3 不同培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)情況Tab.3 The statistics of callus induce on different culture medium

表4 愈傷組織誘導(dǎo)方差分析Tab.4 Variance analysis of callus induced

表5 不同培養(yǎng)基愈傷組織增殖情況Tab.5 The statistics of callus proliferate on different culture medium

表6 愈傷組織增殖方差分析Tab.6 Variance analysis of callus proliferate

圖2 增殖中的愈傷組織Fig.2 Callus in proliferating

(2)植物愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖受很多因素的相互影響。實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法，可以實(shí)現(xiàn)以少量的實(shí)驗(yàn)次數(shù)來完成多種因素多個(gè)水平產(chǎn)生的影響。然而，正交實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果只不過是一個(gè)理論上的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，實(shí)際應(yīng)用中還應(yīng)考慮多種外在因素的綜合效應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)在綜合考慮誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)量的前提下，沒有選擇統(tǒng)計(jì)分析得出的結(jié)果，而是選擇了6－BA 1.0(mg/L)的方案。

(3)植物中的次生代謝產(chǎn)物含量受到很多因素的影響。本文只是考察了最基本的鹽離子濃度和外源激素的影響，保證愈傷組織增長(zhǎng)量的前提下選擇有效成分含量相對(duì)較高的配比。可以在基本培養(yǎng)條件確定后，進(jìn)一步嘗試通過液體搖床培養(yǎng)，添加前提誘導(dǎo)物等一系列手段來提高其中有效成分含量，達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)要求。

(4)本實(shí)驗(yàn)對(duì)愈傷組織只做了總黃酮含量的分析，至于其它成分的影響還有待研究。文中總黃酮含量測(cè)定的方法與陳優(yōu)生［11］所報(bào)道的方法有較大差異，似乎說明不同材料同一種有效成分其所使用的提取方法也有所差異。至于文中以愈傷組織為材料進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定的方法，還沒有相關(guān)報(bào)道。但由于本文只是以總黃酮含量作為一個(gè)指標(biāo)來指導(dǎo)篩選出有效成分含量相對(duì)高的培養(yǎng)條件，所以也就沒有必要一定找出一種適合于提取仙鶴草愈傷組織總黃酮的方法。同時(shí)，由于本文所做的只是一個(gè)相對(duì)含量的測(cè)定，以實(shí)驗(yàn)組相互對(duì)照，所以還不能判斷通過該種不同培養(yǎng)條件的變化來影響其有效成分含量的方法得出的含量是否能達(dá)到或超過野生狀態(tài)。本文對(duì)總黃酮的含量也只是一個(gè)很粗放的測(cè)定，如果條件允許，可以進(jìn)一步使用HPLC等手段進(jìn)行各種單體的含量檢測(cè)比較。

［1］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:53.

［2］洪閣，戴永紅.仙鶴草化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)服務(wù)與研究，2008，8(5):362－366.

［3］巴曉雨，何永志.仙鶴草研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(5):258 －261.

［4］陳茂花.我國(guó)常用野菜簡(jiǎn)介［J］.生物學(xué)教學(xué)，2002，27(6):44 －46.

［5］吳周水.仙鶴草在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，1998(5):32－32.

［6］高文遠(yuǎn)，賈偉.藥用植物大規(guī)模組織培養(yǎng)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:57－118.

［7］方桂珍，孫曉軼.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選仙鶴草中總黃酮的提取工藝［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2002，22(3):62－64.

［8］薛建平，張愛民.安徽藥菊葉片直接再生植株技術(shù)的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2004，29(2):132－135.

［9］趙妮，鄒志榮.君子蘭葉片組織培養(yǎng)研究初報(bào)［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(4):51－52.

［10］王建湘.草莓組織培養(yǎng)葉片再生技術(shù)研究［D］.長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［11］陳優(yōu)生，張焜.正交試驗(yàn)優(yōu)選仙鶴草中總黃酮提取工藝［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14(12):1389－1390.