白背三七愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件優(yōu)化

郭紫娟，上官新晨，蔣 艷，尹忠平

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/江西省高校天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點實驗室，江西 南昌 330045)

白背三七［Gynura divaricata(L.)dc.］為菊科菊三七屬植物，又名白子菜、白背菜，分布于中國南部、西南部和臺灣［1］。白背三七植株主要含有黃酮、三萜、甾醇及核苷類等化學(xué)成分，根、莖和葉均可入藥，具有清熱解毒、舒筋接骨、涼血止血、散瘀消腫、降血糖降血壓之功效［2－5］。民間素有將白背三七地上部分作為食藥兩用之品，廣泛用于治療“三高”病等，具有較高的開發(fā)價值。然而，白背三七野生資源破壞十分嚴重，植株結(jié)實性差，種子數(shù)量少，傳統(tǒng)扦插繁殖方法有限，無法進行大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，不能滿足市場的需求［6］。

利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分是近年來發(fā)展起來的新領(lǐng)域，已成為開發(fā)藥用植物資源的重要途徑［7］。植物細胞生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物具有提高產(chǎn)率、縮短周期、提高產(chǎn)品質(zhì)量、不占用耕地、不受地理環(huán)境和氣候影響等顯著特點［8］。目前，白背三七組織培養(yǎng)的研究多集中在快繁方面，如黃余磊等［6］、黃麗莉等［9］建立了成本低廉、周期短的快速繁殖體系。而關(guān)于建立白背三七細胞培養(yǎng)體系并生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的研究鮮有報道，本文擬研究白背三七愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基及激素組合，為開發(fā)利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)白背三七天然活性成分奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白背三七葉:采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園。

1.2 外植體消毒

采集3—7月初的白背三七帶芽嫩葉、莖段，用流水沖洗2 h，于超凈工作臺作消毒處理［6，9］:20 g/L洗衣粉水溶液漂洗5 min，自來水沖洗30 min，體積分數(shù)75%乙醇浸泡表面20 s，1 g/L升汞溶液消毒5 min，20 g/L次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗4～6次，然后將外植體切成含1～2個芽的小段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

將白背三七帶芽嫩葉、莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上［6，9］(MS 培養(yǎng)基 +1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4 －D+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6－BA+30 g/L 的蔗糖 +6 g/L瓊脂，pH 值6.0)，在相對濕度40% ～60%、(25±2)℃下暗培養(yǎng)數(shù)日，每隔2 d觀察1次并記錄。

1.4 繼代培養(yǎng)基的初步篩選

將初代萌發(fā)的愈傷組織轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)(每天光照14 h，光照強度1 000～1 500 lx)，培養(yǎng)基及其他培養(yǎng)條件同1.3，每15 d轉(zhuǎn)接一次。至第6代后，將愈傷組織接種于MS、B5、N6、WPM、White及DKW 6種培養(yǎng)基上，均附加1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4 －D+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6 － BA，以細胞凈生長量及生長狀態(tài)(顏色、質(zhì)地、生長快慢、穩(wěn)定性)為指標，挑選狀態(tài)較一致的培養(yǎng)物用于篩選適合愈傷組織穩(wěn)定生長的繼代培養(yǎng)基［9］，18 d后收集。

1.5 激素組合對愈傷組織生長效果的影響

在 MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中研究激素(KT、2，4 －D、NAA、6 －BA)，質(zhì)量濃度0，0.3，0.5，1 mg/L 對愈傷組織生長的影響;在B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中研究激素KT與2，4－D組合，6－BA與NAA組合分別在質(zhì)量濃度0.5～10 mg/L對愈傷組織生長的影響。

表1 MS培養(yǎng)基中L16(45)正交試驗因素水平Tab.1 Level and factor of L16(45)orthogonal experiments in MS culture

1.6 愈傷組織生長曲線的繪制

以B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6－BA為繼代培養(yǎng)基，研究白背三七愈傷組織生長過程中生物量及生長狀態(tài)的變化，繪制白背三七愈傷組織生長曲線，確定愈傷組織繼代、收獲的最佳時期。

1.7 愈傷組織生長量的測定［10］

生長量以鮮質(zhì)量計，每瓶接種1.0 g鮮質(zhì)量。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用DPS軟件(vb5.55專業(yè)版)，對數(shù)據(jù)進行鄧肯氏分析，以上試驗每個處理5次平行，2次重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

圖1 白背三七愈傷組織生長狀態(tài)Fig.1 The growth shape of Gynura divaricata(L.)DC.callus

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

分別取3—7月白背三七帶芽嫩葉、莖段接種于MS培養(yǎng)基 +1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4－D+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6－BA中暗培養(yǎng)數(shù)日。15 d后接種的帶芽嫩葉明顯增厚，體積膨大，切口周圍先形成白須狀組織，逐漸轉(zhuǎn)綠、變黃，如圖1a;而莖段則逐步褐化，無愈傷組織出現(xiàn)。在第16～20天生長較迅速，出現(xiàn)暗黃色、綠色等致密的愈傷組織，如圖1b，而后逐漸褐化、變老。在第22天于相同培養(yǎng)基中進行首次繼代，隨著繼代次數(shù)增加，愈傷組織呈現(xiàn)疏松的生長狀態(tài)，培養(yǎng)周期也縮短，繼代4～5次后縮短至18 d，如圖1c—圖1d。

對3—7月初的白背三七帶芽嫩葉進行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳時期為3月份，5月份好于4月份，6月份之后基本不能誘導(dǎo)出愈傷組織。由于南方3月上旬至4月中旬的梅雨影響，4月份所誘導(dǎo)的愈傷組織在繼代培養(yǎng)的過程中易“夭折”即出現(xiàn)褐化、染菌、死亡等現(xiàn)象，不易增殖成活。

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對愈傷組織生長效果的影響

試驗結(jié)果表明，白背三七愈傷組織在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長情況具有極顯著差異;總體而言，以在MS、B5培養(yǎng)基中生長的較好。MS為高鹽成分培養(yǎng)基，其中硝酸鹽、銨鹽、鉀鹽含量較高，微量元素種類齊全，養(yǎng)分均衡，在組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣;B5含較高的鹽酸硫胺素適合雙子葉植物［8］。初代愈傷組織在MS培養(yǎng)基上增殖較快，呈現(xiàn)綠色、疏松顆粒狀態(tài)，生物增長量達13.28 g/瓶;在B5培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)黃色、疏松顆粒狀態(tài)，生物量最高可達15.68 g/瓶;在WPM培養(yǎng)基上達13.63 g/瓶，但愈傷組織呈深綠、水漬狀，轉(zhuǎn)接數(shù)代后即易褐化、死亡。綜上所述:初代愈傷組織在MS和B5兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上有較好的培養(yǎng)效果。

表2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基對愈傷組織生物量積累及生長狀態(tài)的影響Tab.2 The influence of basic medium in the callus biomass accumulation and growth shape

2.3 激素組合對愈傷組織生長效果的影響

2.3.1 MS培養(yǎng)基中激素組合對愈傷組織生長效果的影響 白背三七愈傷組織可在2、5、9、13、14號試驗的激素水平下獲得較高的生物量(表3)。而從生長狀態(tài)來看:愈傷組織在含有激素2，4－D的2、14號試驗下呈現(xiàn)致密、深黃、水漬狀等不良的現(xiàn)象，不利于繼代培養(yǎng);在不含有激素2，4－D的5、9、13號試驗下呈現(xiàn)黃白、疏松有光澤的良好狀態(tài);另在其他含有2，4－D激素的培養(yǎng)基中愈傷組織生物量積累也不高，生長狀態(tài)不良。由此推斷，細胞生長素2，4－D可能對繼代培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生一定的毒害作用，明顯抑制白背三七愈傷組織增殖。有研究報道［11］，用成熟種子誘導(dǎo)胚性愈傷時，需較高濃度2，4－D;但單雙子葉植物在誘導(dǎo)分化后必須及時降低或去掉2，4－D胚性細胞才能正常生長。進一步驗證試驗表明白背三七愈傷組織能夠在13號條件即MS+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L NAA+0.3 mg/L 6－BA培養(yǎng)基中更穩(wěn)定的生長，愈傷組織呈現(xiàn)白綠帶黃、疏松有光澤的狀態(tài)(圖1c)。

表3 MS培養(yǎng)基中白背三七愈傷組織生長試驗結(jié)果Tab.3 The growth experiment results of Gynura divaricata(L.)DC.callus in MS culture

2.3.2 B5培養(yǎng)基中激素組合對愈傷組織生長效果的影響 筆者對細胞分裂素KT與生長素2，4－D進行試驗，發(fā)現(xiàn)愈傷組織呈致密、水漬狀，生長狀態(tài)不良。這一現(xiàn)象與在含有2，4－D激素的MS培養(yǎng)基上相似，也說明白背三七愈傷組織在繼代培養(yǎng)中應(yīng)該脫除細胞生長素2，4－D。表4為6－BA與NAA激素組合試驗篩選的部分結(jié)果。

表4 B5培養(yǎng)基中白背三七愈傷組織生長試驗結(jié)果Tab.4 The growth experiment results of plant hormones types and concentration in Gynura divaricata(L.)DC.callus

當兩激素總質(zhì)量濃度為3 mg/L時，6－BA與NAA質(zhì)量濃度之比［12］在0.5～4皆能夠較好的積累白背三七愈傷組織。當NAA為0.5 mg/L時，不斷擴大6－BA至10 mg/L，愈傷組織皆能積累到較高的生物量，說明白背三七愈傷組織能夠適應(yīng)較高的6－BA質(zhì)量濃度。在B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，適合愈傷組織增殖的激素組合為(0.5～2)mg/L NAA和(3～1)mg/L 6－BA。進一步驗證試驗表明白背三七愈傷組織能夠在B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6－BA 培養(yǎng)基中更穩(wěn)定的生長，愈傷組織呈現(xiàn)黃白、疏松有光澤的狀態(tài)(圖1d)。

圖2 白背三七愈傷組織在B5培養(yǎng)基上生長曲線Fig.2 The growth curve of Gynura divaricata(L.)DC.callus in B5 culture

2.3.3 愈傷組織在2種繼代培養(yǎng)基上的生長比較 愈傷組織在 MS附加1.0 mg/L KT、1.0 mg/L NAA、0.3 mg/L 6－BA的培養(yǎng)基上繼代30次后，逐漸變致密、老化、死亡，呈現(xiàn)“反愈傷化”生長現(xiàn)象，如圖1b中綠色致密狀。這一現(xiàn)象在植物組織培養(yǎng)中較易出現(xiàn)，愈傷組織長期繼代培養(yǎng)會引起細胞內(nèi)染色體的變異，出現(xiàn)多倍體、非正倍體、染色體丟失、斷裂或重組，導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定［8］。但將這種綠色致密型愈傷組織轉(zhuǎn)接至B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6－BA培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)代后，愈傷組織逐漸呈現(xiàn)疏松易碎、有金屬光澤、生長旺盛的狀態(tài)，說明更能適應(yīng)白背三七愈傷組織長期穩(wěn)定生長的培養(yǎng)基為B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6 －BA。

2.4 白背三七愈傷組織在B5培養(yǎng)基上的生長曲線

由圖2可知，愈傷組織在B5繼代培養(yǎng)基上呈平緩的“S”型生長曲線，在生長過程中經(jīng)歷以下4個時期:延遲期、指數(shù)期、靜止期和衰退期。愈傷組織經(jīng)過2～4 d短暫適應(yīng)后便逐步生長，第6天開始進入快速生長的指數(shù)期，第18天生物量達到最大值19.54 g/瓶，第22天后愈傷組織開始衰老，此時褐化較快。白背三七愈傷組織最佳繼代時間為第16～18天，最佳的收獲時期為第18～20天。

3 討論

白背三七是草本植物，含有較多的酚酸類物質(zhì)，致使該植物在組織培養(yǎng)過程中易褐變，受到污染甚至死亡的概率較高。外植體消毒過程中，體積分數(shù)75%的乙醇浸泡時間不能超過1 min，否則材料易被褐化、死亡;升汞溶液、次氯酸鈉溶液的濃度在消毒范圍內(nèi)應(yīng)盡量低，以免材料被殺死;多次用無菌水沖洗，防止消毒液殘留毒害材料。

白背三七愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)研究表明，帶芽嫩葉(3月份采摘)接種MS+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4－D+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6－BA培養(yǎng)基上15 d即能誘導(dǎo)出愈傷組織;而黃余磊等［6］通過在MS+0.5 mg/L BAP+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)白背三七草葉片、葉柄、莖段，接種55 d才產(chǎn)生愈傷組織。這可能是添加的植物外源激素種類與含量不同所致。因為植物的生長與分化不僅取決于外源激素的添加量，而且細胞分裂素與生長素的比例也起著至關(guān)重要的作用。外源激素可通過影響內(nèi)源激素的合成和代謝而最終影響內(nèi)源生長素和細胞分裂素的水平［13］。

在白背三七愈傷組織繼代培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，無論是在MS還是B5培養(yǎng)基中，細胞生長素2，4－D對愈傷組織的生長具有明顯的抑制作用，具體的抑制機制有待進一步研究。在B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6－BA培養(yǎng)基中可獲得疏松易碎、有金屬光澤、生長旺盛的愈傷組織，第18天生物量達到最大值19.54 g/瓶，其中含有的有效活性成分也有待進一步分析檢測。

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