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    轉(zhuǎn)NAT3基因水稻氮素利用效率分析

    2015-01-27 11:04:05查中萍,萬(wàn)丙良,杜雪樹(shù),殷得所,戚華雄
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年23期

    查中萍,萬(wàn)丙良,杜雪樹(shù),殷得所,戚華雄

    摘要:對(duì)海洋硅藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NAT3編碼基因的單拷貝插入轉(zhuǎn)基因水稻純系進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),獲得NAT3基因的超表達(dá)株系。NAT3超表達(dá)株系中硝酸還原酶基因OsNR1的轉(zhuǎn)錄較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1顯著增強(qiáng)。對(duì)超表達(dá)株系及對(duì)照中花11進(jìn)行不同氮素濃度的培養(yǎng)和栽培試驗(yàn)。結(jié)果表明,在低氮培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)NAT3基因水稻的幼苗干重較中花11高;在低氮盆栽條件下,轉(zhuǎn)NAT3基因超表達(dá)株系的葉綠素含量、生物學(xué)產(chǎn)量和植株的含氮量均較相同氮素條件下的中花11高,說(shuō)明NAT3基因超表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因水稻在低氮條件下的氮素利用效率,促進(jìn)水稻生長(zhǎng)。

    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因水稻;硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;氮素利用效率

    中圖分類號(hào):S511 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A ? ? ? ?文章編號(hào):0439-8114(2014)23-5653-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.009

    水稻是我國(guó)主要的糧食作物,種植面積占糧食作物總面積的27%,產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)的44%[1]。長(zhǎng)期以來(lái),水稻育種多以高產(chǎn)、耐肥抗倒作為主要育種目標(biāo),因?yàn)樽非蟾弋a(chǎn)導(dǎo)致氮肥施用量大幅度增加[2]。大量氮肥的使用不僅提高了水稻的種植成本,導(dǎo)致增產(chǎn)不增收,而且還帶來(lái)水體硝酸鹽污染的潛在危險(xiǎn),對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生極為不利的影響[3]。由于氮肥利用率的下降,氮肥過(guò)量施用造成的環(huán)境負(fù)效應(yīng)也越來(lái)越引起廣泛關(guān)注[4-8]。因此,通過(guò)遺傳改良提高水稻品種的氮素吸收利用能力,降低氮肥使用量是發(fā)展水稻生產(chǎn)急需解決的重要問(wèn)題。

    水稻根系對(duì)土壤中氮素的吸收是決定水稻氮素利用效率的前提。硝酸鹽是植物可直接利用的主要氮源之一,植物對(duì)硝酸鹽的吸收主要依靠硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成。深海硅藻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與氮具有高度親和性,在低氮環(huán)境下轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,可使硅藻從硝酸鹽濃度極低的海水中富集硝酸鹽[9]。NAT3是劉昱輝等[10]從深海硅藻中克隆的一個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將NAT3基因?qū)胨酒贩N中花11,獲得了NAT3基因的轉(zhuǎn)基因植株[11]。本研究通過(guò)熒光定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中NAT3基因表達(dá)量進(jìn)行分析,獲得NAT3基因超表達(dá)純系,并進(jìn)一步通過(guò)不同氮濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)及盆栽試驗(yàn),測(cè)定轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照受體材料中花11的生長(zhǎng)量及植株含氮量,并分析NAT3基因的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的氮素利用率的影響,為應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育氮肥高效利用水稻提供理論依據(jù)。本研究對(duì)減少水稻生產(chǎn)中的氮肥施用量、節(jié)約水稻生產(chǎn)成本、降低環(huán)境污染、促進(jìn)農(nóng)業(yè)高效節(jié)能可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

    1 ?材料與方法

    1.1 ?試驗(yàn)材料

    本試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因株系是以中花11為受體的轉(zhuǎn)NAT3基因T4代單拷貝插入純系[11]。非轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)照材料為中花11,由湖北省糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室繁殖保存。

    1.2 ?NAT3基因及硝酸還原酶基因OsNR1表達(dá)量的測(cè)定

    取三葉一心期的水稻幼苗(包括根),利用Trizol試劑抽提總RNA,通過(guò)瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量和濃度。取5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA,采用Roche公司的定量檢測(cè)試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)進(jìn)行定量PCR分析,內(nèi)標(biāo)基因?yàn)閍ctin基因。引物由Invitrogen中國(guó)公司合成。擴(kuò)增體系25 μL,其中12.5 μL 2× qPCR Mix ,2.0 μL引物,2.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,8.0 μL ddH2O 。擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃,10 min;95 ℃變性15 s, 58 ℃下退火20 s,72 ℃下延伸20 s, 40 次循環(huán);72 ℃延伸5 min。采用ΔΔCT法進(jìn)行結(jié)果處理。

    1.3 ?不同氮濃度培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)NAT3基因水稻幼苗的生長(zhǎng)狀況測(cè)定

    NAT3基因超表達(dá)株系及對(duì)照中花11的成熟胚經(jīng)消毒后,于MS培養(yǎng)基上獲得無(wú)菌苗,選取生長(zhǎng)狀況一致的幼苗,去除胚乳后移栽到1/2MS、1/4MS、1/8MS 3個(gè)不同氮濃度的培養(yǎng)基上(1/2MS、1/4MS、1/8MS表示MS培養(yǎng)基中大量元素中的氮素減半,其余成分不變)。每個(gè)處理種植5株,40 d后取樣,測(cè)定各處理5個(gè)植株的整株干重。

    1.4 ?轉(zhuǎn)NAT3基因水稻盆栽試驗(yàn)

    盆栽基土為含氮量低的黃棕壤,堿解氮含量74.57 mg/kg。曬干后稱取8 kg/(盆·干土),分別按不同氮素處理加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)元素。盆栽試驗(yàn)氮肥處理濃度設(shè)計(jì)如表1所示,在施用相同磷、鉀肥的基礎(chǔ)上,設(shè)4個(gè)氮素處理,分別為全氮(1N)、1/3氮(1/3N)、1/6氮(1/6N)、不施N肥(0N,空白對(duì)照),分基肥、分蘗肥和抽穗肥三期施用。NAT3基因超表達(dá)株系及對(duì)照中花11種子在育秧盤中播種,至四葉一心時(shí)選取生長(zhǎng)一致的幼苗移栽,每盆種植4株,每個(gè)氮素處理種植6盆。抽穗期取3盆植株進(jìn)行葉片葉綠素含量。成熟后另外3盆收獲整個(gè)植株(包括根系),烘干后測(cè)定生物學(xué)產(chǎn)量和含氮量。

    1.5 ?葉綠素含量測(cè)定

    抽穗期取倒二葉片,每個(gè)處理取3個(gè)葉片,每個(gè)葉片測(cè)定2次。參考文獻(xiàn)[12]測(cè)定葉綠素含量。

    1.6 ?水稻植株含氮量及生物學(xué)產(chǎn)量測(cè)定

    收獲轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照水稻整個(gè)植株(包括根系),洗凈烘干后稱重待測(cè)。用凱氏定氮法測(cè)定植株含氮量。

    2 ?結(jié)果與分析

    2.1 ?轉(zhuǎn)基因株系中NAT3基因及硝酸還原酶基因OsNR1的表達(dá)

    不同轉(zhuǎn)基因株系中NAT3和OsNR1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況如圖1所示。10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有8個(gè)株系的NAT3基因有不同程度的轉(zhuǎn)錄表達(dá),其中T4-1、T4-2及T4-3的NAT3基因轉(zhuǎn)錄量較高,而株系T4-9、T4-10及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1中無(wú)NAT3基因轉(zhuǎn)錄。OsNR1基因在株系T4-1、T4-2及T4-3中有較高的表達(dá)量,高于在其他轉(zhuǎn)基因株系與中花11中的表達(dá)量。OsNR1基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)趨勢(shì)與NAT3基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。同中花11相比,株系T4-1、T4-2及T4-3中OsNR1的轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)。結(jié)果說(shuō)明,NAT3基因整合到水稻基因組中后,能夠正常表達(dá),而且其超表達(dá)促進(jìn)了下游硝酸還原酶OsNR1基因的表達(dá)。選擇NAT3和OsNR1基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因株系T4-1、T4-2及T4-3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

    2.2 ?不同氮濃度培養(yǎng)基上NAT3基因超表達(dá)株系幼苗的生長(zhǎng)狀況

    在不同氮濃度培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因株系T4-1、T4-2、T4-3及對(duì)照中花11幼苗的干重結(jié)果如表2所示。由表2可知,在1/2MS、1/4MS、1/8MS 3種氮濃度培養(yǎng)基上,3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系40 d齡幼苗的干重均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1的幼苗干重,其中在1/4MS和1/8MS培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因株系的幼苗干重與對(duì)照之間的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。結(jié)果表明,同對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在低氮環(huán)境下的生長(zhǎng)速度快于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?/p>

    2.3 ?NAT3基因超表達(dá)水稻葉綠素含量分析

    不同氮素營(yíng)養(yǎng)條件下,轉(zhuǎn)基因株系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1抽穗期倒二葉葉綠素含量如表3所示。由表3可知,隨著氮素使用量的降低,NAT3基因超表達(dá)株系及中花11的葉片葉綠素a和葉綠素b含量均有不同程度的下降;在1/3N、1/6N及0N處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)基因株系葉綠素a含量較對(duì)照中花11高,但無(wú)顯著差異(P<0.05);T4-3在1/3N、1/6N和0N的低氮條件下的葉綠素b含量均顯著(P<0.05)高于對(duì)照中花11。結(jié)果表明,在低氮環(huán)境下NAT3基因超表達(dá)株系葉綠素含量較對(duì)照有所增加,其中株系T4-3中葉綠素b含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?/p>

    2.4 ?NAT3基因超表達(dá)水稻植株含氮量及生物學(xué)產(chǎn)量

    不同氮素營(yíng)養(yǎng)條件下,NAT3基因超表達(dá)株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩谢?1的含氮量和生物學(xué)產(chǎn)量結(jié)果如表4所示。由表4可知,轉(zhuǎn)基因株系在1/3N、1/6N的條件下,其植株的生物學(xué)產(chǎn)量和含氮量均高于對(duì)照,其中T4-1株系在1/3N、1/6N的低氮條件下,其生物學(xué)產(chǎn)量和含氮量較對(duì)照的差異均達(dá)顯著水平(P<0.05);T4-3株系在1/3N、1/6N低氮條件下的生物學(xué)產(chǎn)量較對(duì)照的差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。說(shuō)明NAT3基因的超表達(dá)能提高水稻對(duì)氮肥的利用效率,提高植株含氮量和生物學(xué)產(chǎn)量。

    3 ?小結(jié)與討論

    硝態(tài)氮(NO3-)是植物吸收利用的主要氮源之一。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要組成部分,分為低親和性和高親和性兩類。大量研究已經(jīng)證明,高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)低NO3-濃度時(shí)植物氮的吸收[13-15]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT2.1缺失突變的擬南芥喪失75%的高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活性[16,17],因此導(dǎo)致在以NO3-為惟一氮源的低氮環(huán)境下不能正常生長(zhǎng)[18]。然而通過(guò)在植物中超表達(dá)高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因改變植物的氮素利用效率的研究鮮有。Fraisier等[19]在煙草中超表達(dá)高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NpNRT2.1,結(jié)果表明,不論環(huán)境中提供的NO3-濃度水平如何,轉(zhuǎn)基因煙草和野生型對(duì)照中的NO3-含量無(wú)顯著差異。

    本研究中,NAT3基因在水稻中超表達(dá)后,促進(jìn)了硝酸還原酶OsNR1基因的表達(dá)。在低氮條件下,轉(zhuǎn)基因植株的含氮量較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭?,表明NAT3基因的超表達(dá)在低氮環(huán)境下促進(jìn)了氮的吸收。在正常氮水平條件下,NAT3基因的超表達(dá)并不能促進(jìn)氮的吸收。這是因?yàn)镹AT3屬于高親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使其主要在低氮環(huán)境下起作用[20]。同轉(zhuǎn)NAT3基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素吸收效率增強(qiáng)一致,在低氮環(huán)境下轉(zhuǎn)NAT3基因水稻的生物學(xué)產(chǎn)量和葉片葉綠素含量較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站兴岣?。但轉(zhuǎn)NAT3基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素含量、葉片葉綠素含量和生物學(xué)產(chǎn)量均低于正常環(huán)境下的相應(yīng)指標(biāo),說(shuō)明,轉(zhuǎn)NAT3基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素吸收效率雖然有所提高,但在本試驗(yàn)所設(shè)置的低氮條件下仍未達(dá)到滿足水稻正常生長(zhǎng)發(fā)育所需的水平。

    中國(guó)的水稻氮肥施用量占全球水稻氮肥施用量的37%,氮肥利用率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于全球的平均水平[21]。過(guò)量施用氮肥導(dǎo)致環(huán)境污染,也增加了農(nóng)民的水稻種植成本。本研究獲得的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NAT3轉(zhuǎn)基因水稻在低氮環(huán)境下的氮素吸收效率高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?,為利用生物技術(shù)提高水稻的氮素利用效率、減少氮肥的過(guò)量使用提供了有效的技術(shù)途徑。

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