點(diǎn)帶石斑魚魚皮和鱗片膠原蛋白的提取及理化性質(zhì)的研究

黃亞冬，邢克智，劉海學(xué)，王金娥，陳成勛，王慶奎

（天津農(nóng)學(xué)院a.水產(chǎn)科學(xué)系，b.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c.農(nóng)業(yè)分析測試中心，天津 300384）

膠原蛋白（collagen）是生物體內(nèi)廣泛存在的一種重要蛋白質(zhì)，也是結(jié)締組織的主要蛋白成分.與來源于陸生哺乳動物的膠原蛋白相比，水產(chǎn)動物原料通常具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，能夠避免動物性傳染病的傳播，安全性好，非常適宜于制備膠原產(chǎn)品[1].近年來以水產(chǎn)動物為原料制備的膠原蛋白產(chǎn)品被世界公認(rèn)為一種安全性較高的膠原蛋白來源，備受國內(nèi)外消費(fèi)市場的青睞.

點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus malabaricus），隸屬鱸形目（Perciformes）、科（Serranidae）、石斑魚屬（Epinephlus）.其營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美，蛋白含量高，富含必需氨基酸，為優(yōu)質(zhì)的食用經(jīng)濟(jì)魚類，是許多國家捕撈和養(yǎng)殖的對象.本課題組以點(diǎn)帶石斑魚為實(shí)驗(yàn)材料，從魚皮和魚鱗中提取膠原蛋白，并通過紫外吸收、氨基酸分析、SDS-PAGE 電泳分析和傅里葉變換紅外光譜對膠原蛋白的純度和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，為點(diǎn)帶石斑魚膠原蛋白的制備和應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原材料預(yù)處理

點(diǎn)帶石斑魚凍品低溫解凍后，在冰水浴中手工剝離魚皮和魚鱗，去除魚皮下的脂肪、肌肉組織以及魚鱗中的雜物，自來水洗凈，瀝干.

1.1.2 試劑與儀器

SDS-PAGE 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，加拿大Fermentas 公司生產(chǎn)；牛跟腱Ⅰ型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BATC），北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；L-羥脯氨酸、氯胺T、二甲基氨基苯甲醛、丙烯酰胺、N，N′-甲叉雙丙烯酰胺、三羥基氨基甲烷（Tris）、過硫酸銨、四甲基二乙胺，均為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；所用試劑均為國產(chǎn)分析純級.

雙光束紫外可見分光光度計UV-1901，北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn)；冷凍干燥機(jī)FPL1-1200，上海愛朗儀器有限公司生產(chǎn)；差示掃描量熱儀DSC6220，精工電子納米科技有限公司生產(chǎn)；高速低溫離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)；氨基酸全自動分析儀HITACH L-8900，日本HITACH 公司生產(chǎn)；傅里葉變換紅外光譜儀Spectrum 65，美國PerkinElmer 公司生產(chǎn)；電泳凝膠成像分析儀SN-NJ060C，北京信諾萊伯儀器有限公司生產(chǎn).

1.2 膠原蛋白的提取

將魚皮剪碎，用體積分?jǐn)?shù)為10%的正丁醇在4 ℃下攪拌脫脂24 h，蒸餾水洗凈后用0.1 mol/L NaOH 在4 ℃下攪拌6 h，去除雜質(zhì)蛋白.過濾，用蒸餾水洗至中性，冷凍干燥.

將魚鱗浸泡于0.5 mol/L 的EDTA 溶液（pH7.4）中，4 ℃下攪拌脫鈣48 h，每12 h 更換1 次溶液，然后用去離子水清洗，瀝干，冷凍干燥.

1.3 膠原蛋白的純化

稱取1.2 中魚皮和魚鱗凍干品各2 g，分別加入0.5 mol/L 冰醋酸溶液攪拌24 h 后，10 000 r/min 離心30 min，沉淀用同樣的條件再處理1 次，合并2次上清液，加NaCl 至終濃度0.9 mol/L，鹽析過夜.10 000 r/min 離心30 min，棄上清液.沉淀用0.5 mol/L 冰醋酸溶液溶解，10 000 r/min 離心30 min.取上清液，重復(fù)鹽析和溶解，用0.1 mol/L 冰醋酸溶液透析48 h 脫鹽，再用蒸餾水透析24 h，冷凍干燥.所有處理及操作均在4 ℃下進(jìn)行.

1.4 膠原蛋白純度及理化性質(zhì)測定

膠原蛋白純度的測定，參照Reddy 等[2]的方法；熱變性溫度測定，參照Kanokwan 等[3]的方法；膠原蛋白氨基酸分析，參照GB/T 18246-2000 的方法；傅里葉變換紅外光譜（FTIR），采用傅里葉變換紅外光譜儀測定其吸收光譜，參照Wang 等[4]的方法；電動勢及溶解度分析，參照Kanokwan 等[3]的方法.

紫外可見光譜掃描：準(zhǔn)確稱取純化的膠原蛋白樣品，溶解于0.5 mol/L 冰醋酸溶液中（4 ℃下進(jìn)行），配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%膠原蛋白溶液.樣品處理液采用雙光束紫外可見分光光度計進(jìn)行紫外可見光譜掃描，波長間隔1 nm，波長為190～400 nm.

SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：參照Wang 等[4]的方法并稍作改動.即SDS-PAGE 采用6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分離膠與5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）濃縮膠不連續(xù)電泳系統(tǒng)，具體配方如表1 所示.將膠原蛋白樣品溶解于0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）至最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，將樣品溶液與樣品緩沖液等體積混合，100 ℃水浴5 min 后取出立即放入冰水浴中冷卻，然后4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，取15 μL 上清液至垂直電泳槽，在50 mA 電流下電泳，最后進(jìn)行染色脫色處理.

表1 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳配方Tab.1 Formula of SDS polyacrylamide gel electrophoresis mL

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SE）表示，在單因子方差分析的基礎(chǔ)上采用Duncan 多重比較法檢驗(yàn)組間差異（P=0.05）.所有數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS17.0 進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原蛋白的提取率及其純度

魚皮膠原蛋白（SKC）和魚鱗膠原蛋白（SCC）的提取率分別為76.21%和2.50%.吸光度值（A）和樣品中羥脯氨酸濃度（C）呈線性正相關(guān)，回歸方程為：A=0.073 4C+0.002 8（R2=0.999 3）.永井裕等[5]認(rèn)為羥脯氨酸僅存在于膠原蛋白、彈性蛋白和伸展蛋白中，而不存在于一般蛋白質(zhì)中，其在膠原蛋白中的含量為膠原氨基酸總質(zhì)量的10%左右.

經(jīng)測定，本研究提取的SKC 和SCC 的純度分別為91%和85%.

2.2 紫外可見光譜掃描分析

將提取的SKC 和SCC 用0.5 mol/L 冰醋酸溶液溶解，在190～400 nm 的近紫外光區(qū)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果如圖1 所示.SKC 和SCC 在231 nm 處具有最大吸收峰，牛跟腱Ⅰ型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在232 nm 處具有最大吸收峰，A 值分別為0.516、0.454 和0.532，符合膠原蛋白通常的紫外吸收特性，即SKC和SCC 存在Ⅰ型膠原蛋白的特征吸收峰.

2.3 熱變性溫度（DSC）的測定

SKC 和SCC 的DSC 曲線如圖2 所示.SKC 的熱變性溫度為40.16 ℃，SCC 的熱變性溫度為42.06 ℃，這表明SCC 的熱穩(wěn)定性稍高于SKC.點(diǎn)帶石斑魚生活的水溫在15～34 ℃，其膠原蛋白的熱變性溫度高于最大生長溫度，這和一些溫、熱帶魚種來源的膠原蛋白相似，如尼羅河鱸魚（生長溫度18～32 ℃，膠原蛋白熱變性溫度36.5 ℃）、金槍魚（生長溫度20～28 ℃，膠原蛋白熱變性溫度29.7 ℃）、香魚（生長溫度20～28 ℃，膠原蛋白熱變性溫度29.7 ℃）等[4，6-7].這表明膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與來源物種的種類和棲息環(huán)境溫度有關(guān)，此結(jié)論與Rigby 的報道一致[8].

2.4 氨基酸組成

表2 中給出了點(diǎn)帶石斑魚SKC 和SCC 的氨基酸組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù).SKC 和SCC 中含量最豐富的氨基酸為甘氨酸，丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸的含量也很高，而甲硫氨酸、組氨酸含量較低，半胱氨酸和酪氨酸沒有發(fā)現(xiàn)，符合膠原蛋白的氨基酸組成分布[9].魚皮和魚鱗亞氨基酸（脯氨酸）含量分別為4.84%和5.60%，點(diǎn)帶石斑魚較低的亞氨基酸含量與較低的變性溫度符合“蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與亞氨基酸含量呈正相關(guān)”這一結(jié)論[10].

表2 提取膠原蛋白的常規(guī)氨基酸組成Tab.2 Composition of amino acid in soluble collagens extracted from scales and skin of grouper %

2.5 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）

圖3 和表3 顯示了點(diǎn)帶石斑魚SKC、SCC 的紅外吸收光譜及主要吸收峰.

表3 點(diǎn)帶石斑魚SKC 和SCC 的光譜峰位及其歸屬Tab.3 FTIR spectra peak locations and assignments for acid soluble SKC and SCC of grouper

AmideⅠ帶和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，SKC和SCC 的Amide Ⅰ帶分別出現(xiàn)在1 656.95 和1 641.35 cm-1，說明這2 種膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)相似.Amide Ⅲ帶是由N—H 彎曲振動引起的特征吸收峰，SKC 和SCC 的Amide Ⅲ帶分別出現(xiàn)在1 239.58和1 240.00 cm-1，證明提取的膠原蛋白存在完整的三螺旋結(jié)構(gòu)[11].Amide A 峰與N—H 伸縮振動有關(guān)[12]，根據(jù)Doyle 理論，游離的N—H 伸縮振動在3 400～3 440 cm-1，N—H 參與氫鍵形成時振動頻率顯著降低.SKC 的Amide A 在3 436.16 cm-1，SCC 的Amide A 在3 435.94 cm-1，說明2 種膠原蛋白中幾乎沒有或者有很少的N—H 鍵參與氫鍵形成.SKC 的AmideⅠ和AmideⅡ吸收峰振動頻率（分別為1 656.95 cm-1，1 551.33 cm-1）稍高于SCC的值（1 641.35 cm-1，1 554 cm-1），這些峰的振動頻率與膠原蛋白的分子有序度呈正相關(guān)[13]，因此說明SKC 具有比SCC 更高的分子有序度.

2.6 SKC 和SCC 的組成及相對分子質(zhì)量

SKC 和SCC 樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，結(jié)果如圖4 所示.

魚皮和魚鱗所提取出來的膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似，屬于Ⅰ型膠原蛋白，除了α1和α2鏈，還有β 和γ鏈，如表4 所示.通常認(rèn)為β 鏈為α 鏈的二聚體，而γ 鏈為α 鏈的三聚體.α1和α3組分在SDS-PAGE膠上無法辨別[21]，因此條帶α1還可能含有α3成分.

表4 魚皮、鱗片膠原蛋白的相對分子質(zhì)量（以0.8 mg/mL 為例）Tab.4 Chain molecular weight of collagens from skin and scales（0.8 mg/mL，for example）

2.7 電動勢分析

SKC 和SCC 在不同pH 條件下的電動勢如圖5所示.在pH 為2～7 范圍內(nèi)，電動勢值均為正值，而在pH 為8 和9 時出現(xiàn)負(fù)值.由于凈電荷為零處被認(rèn)為是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，因此，由圖5 可得，SKC和SCC 的等電點(diǎn)分別為pH 7.12 和7.15，兩者等電點(diǎn)極為相似，這可能與其氨基酸組成的含量有關(guān).

2.8 溶解性

不同pH 條件下點(diǎn)帶石斑魚SKC、SCC 的溶解性結(jié)果如圖6（a）所示.在酸性pH（2～4）內(nèi)，兩者都表現(xiàn)出高的溶解性（P≤0.05）.pH 值高于4 時，兩者的溶解度均表現(xiàn)出不同的下降趨勢，在中性和弱堿性條件下溶解性降至最低.本文結(jié)論與Bae 等[22]對虎皮膠原蛋白的研究結(jié)果相似.

不同濃度的NaCl 溶液對石斑魚SKC、SCC 的溶解性影響結(jié)果如圖6（b）所示.在10 和20 g/L NaCl 質(zhì)量濃度下兩者的溶解性與對照組（0 g/L NaCl 質(zhì)量濃度）差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）.當(dāng)NaCl 質(zhì)量濃度大于30 g/L 時，2 種蛋白的溶解度急劇下降，這與Ahmad 和Benjakul[23]的結(jié)論相同.NaCl 質(zhì)量濃度在40～60 g/L 時，SKC、SCC 的溶解度很低，這很可能是蛋白質(zhì)的鹽析現(xiàn)象.Woo 等[24]和Bae 等[22]分別從黃鰭金槍魚、褐籃子魚、海圓臉魚類、燕魟、赤魟和煙臺黃貂魚的背部魚皮中提取出膠原蛋白，當(dāng)NaCl 質(zhì)量濃度在40 g/L 時其溶解度也表現(xiàn)出急劇下降趨勢.這也與本研究結(jié)果相似.

3 結(jié)論

本研究從點(diǎn)帶石斑魚的魚皮和魚鱗中提取出了膠原蛋白，并對這2 種膠原蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)論如下：

（1）魚皮中膠原蛋白的提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于魚鱗中的提取率，且純度也高于魚鱗中的膠原蛋白，證明魚皮更適用于提取膠原蛋白；

（2）魚皮和魚鱗中的膠原蛋白均為Ⅰ型，含有α1、α2、β 和γ 鏈，并且具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，二者的氨基酸組成符合一般膠原蛋白的氨基酸組成規(guī)律；

（3）2 種膠原蛋白都是在酸性條件和低NaCl 濃度下有較高的溶解度，符合一般膠原蛋白的溶解性特征.

[1]焦道龍，陸劍鋒，張偉偉，等.水產(chǎn)動物膠原蛋白的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].食品科學(xué)，2009，30（17）：334—338.

[2]REDDY G K，ENWEMEKA C S.A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues[J].Clinical Biochemistry，1996，29（3）：225—229.

[3]KANOKWAN M，SOOTTAWA T，BENJAK L，et al.Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish（Parupeneus heptacanthus）[J].Food Chemistry，2011，129（3）：1179—1186.

[4]WANG L，AN X X，XIN Z H，et al.Isolation and characterization of collagen from the skin of deep-sea redfish（Sebastes mentella）[J].Journal of Food Science，2007，72（8）：451—455.

[5]永井裕，藤本大三郎.劉平譯.膠原蛋白實(shí)驗(yàn)方法[M].上海：上海中醫(yī)學(xué)院出版社，1992：31.

[6]MUYONGA J H，COLE C G B，DUODU K G.Characterization of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch（Lates niloticus）[J].Food Chemistry，2004，85（1）：81—89.

[7]TAKESHI N，EIFI Y，KEI T，et al.Isolation and characterisation of collagen from the outer skin waste material of cuttlefish（Sepia lycidas）[J].Food Chemistry，2001，72（4）：425—429.

[8]RIGBY B J.Amino-acid composition and thermal stability of the skin collagen of the Antarctic ice-fish[J].Nature，1968，219（150）：166—167.

[9]NAGAI T，SUZUKI N T.Collagen from common minke whale（Balaenoptera acutorostrata）unesu[J].Food Chemistry，2008，111（2）：296—301.

[10]IKOMA T，KOBAYASHI H，TANAKA J，et al.Physical properties of type I collagen extracted from fish scales of Pagrus major and Oreochromis niloticas [J].Int J Biol Macromol，2003，32（3/5）：199—204.

[11]LIU H Y，LI D，GUO S D.Studies on collagen from the skin of channel catfish（Ictalurus punctaus）[J].Food Chemistry，2007，101（2）：621—625.

[12]SAI K P，BABU M.Studies on Rana tigerina skin collagen[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2001，128（1）：81—90.

[13]PAYNE K J，VEIS A.Fourier transform IR spectroscopy of collagen and gelatin solutions：Deconvolution of the amide I band for conformational studies[J].Biopolymers，1988，27（11）：1749—1760.

[14]ROCHA-MENDOZA I，YANKELEVICH D R，WANG M，et al.Sum frequency vibrational spectroscopy：The molecular origin of the optical second-order nonlinearity of collagen[J].Bio Phys J，2007，93（12）：4433.

[15]李鑫，劉騫，鄒春虹，等.膠原蛋白對肉嫩度的影響[J].肉類研究，2008（9）：11—14.

[16]BARBARA B，DOYLE E.Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J].Biopolymers，1975，14（5）：937.

[17]BRUCE G，F(xiàn)RUSHOUR J L K.Raman scattering of collagen，gelatin，and elastin[J].Biopolymers，1975，14（2）：379.

[18]BARTH A.Infrared spectroscopy of proteins[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Bioenergetics，2007，1767（9）：1073.

[19]LIU W，LI G，MIAO Y，et al.Preparation and characterization of pepsin-solubilized type I collagen from the scales of snakehead（Ophiocephalus Argus）[J].Journal of Food Biochemistry，2009，33（1）：20—37.

[20]JACKSON M，CHOO L P，WATSON P H，et al.Beware of connective tissue proteins：Assignment and implications of collagen absorptions in infrared spectra of human tissues [J].Biochima et Biophysica Acta（BBA）-Molecular Basis of Disease，1995，1270（1）：1—6.

[21]KIMURA S.Wide distribution of the skin typeⅠcollagen α3chain in bony fish[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，1992，102（2）：255—260.

[22]BAE I，OSATOMI K，YOSHID A A，et al.Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilised fishies[J].Food Chemistry，2008，108（1）：49—54.

[23]AHMAD M，BENJAKUL S.Extraction and characterization of pepsin-solubilized collagen from the skin of unicorn leatherjacket（Aluterus monocerous）[J].Food Chemistry，2010，120（3）：817—824.

[24]WOO J W，YU S J，KIM S B，et al.Extraction optimization and properties of collagen from yellow fin tuna（Thunnus albacares）dorsal skin[J].Food Hydrocolloid，2008，22（5）：879—887.