五種免疫相關(guān)酶在不同年齡組中國大鯢組織內(nèi)的分布及活性比較研究

原居林，辛建美，練青平，楊元杰，劉金殿，張愛菊

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州313001)

中國大鯢(Andrias davidianus)俗稱娃娃魚，隸屬于兩棲綱(Amphibia )、有尾目(Caudata)1、隱鰓鯢科(Cryptobrachidae)、大鯢屬(Andrias)，為我國特有的珍稀水生動物。大鯢是非常古老的物種，是地球生物演變的“活化石”，在研究地球演化、生物進(jìn)化、環(huán)境變遷等方面具有重要的科學(xué)價(jià)值［1－2］。20 世紀(jì)以來，由于自然生境的破壞、餌料生物減少、非法捕殺，加之大鯢資源再生能力差等原因，野生大鯢資源量急劇下降，面臨枯竭的危險(xiǎn)。目前，野生大鯢種群僅存在于人類破壞活動難以涉及的石灰?guī)r溶洞、地下陰河或山溪中。國際瀕臨絕種生物國際貿(mào)易公約(CITES)也將其列為國際極危野生物種，我國已將大鯢列為國家二級瀕危野生保護(hù)動物。

為有效保護(hù)這一珍貴物種，多年來我國學(xué)者先后開展了中國大鯢人工繁殖、病害防治和規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)等研究［3－5］，并取得了較大的進(jìn)展。但近年來隨著養(yǎng)殖集約化程度日趨提升，養(yǎng)殖密度不斷增大，導(dǎo)致大鯢暴發(fā)性疾病日趨嚴(yán)重［6－8］，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ATP)作為重要的免疫相關(guān)酶類，是評價(jià)外來物對水生生物機(jī)體損傷的重要生物學(xué)指標(biāo)，疾病、藥物、污染等因素均會不同程度地影響這些酶類的活性，目前關(guān)于大鯢免疫學(xué)方面的研究較少，僅見于沈國民等［9］分析了大鯢24 種組織堿性磷酸酶的特性和鄭堯［10］介紹了大鯢表皮中存在著免疫相關(guān)酶組分。因此本文通過測定5 種抗氧化酶在3 個(gè)年齡組大鯢不同組織中的分布，揭示其抗氧化功能的主要組織，為今后大鯢這一瀕危物種的保護(hù)和健康養(yǎng)殖提供理論支持。

護(hù)理前，實(shí)驗(yàn)組與參照組患者對糖尿病健康知識的了解評分均較低（P＞0.05）。經(jīng)過為期3個(gè)月的護(hù)理干預(yù)，兩組患者對疾病的了解評分均有所提高（P＜0.05）；且實(shí)驗(yàn)組患者的評分高于參照組（P＜0.05）。見表1。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)大鯢采自浙江省慶元山鼎大鯢研發(fā)有限公司，分別為1 齡、2 齡及3 齡大鯢各3 尾，測試前投喂活體泥鰍幼魚進(jìn)行暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間水溫18 ～20 ℃，微流水養(yǎng)殖。

1.2 酶液制備

將活體大鯢放入－80 ℃冰箱中瞬間冷凍致死，然后進(jìn)行解剖，取一定量的腹部表皮、肝臟、背部肌肉、腸道中段、胃組織樣本在冰浴條件下勻漿，4 ℃2 000 r/min 離心獲得酶液。

1.3 酶活性的測定

3 個(gè)不同年齡組大鯢組織中SOD 活性分布如圖1 所示。從圖1 中可知，3 個(gè)年齡組的大鯢SOD 活性大小依次表現(xiàn)為肝臟、表皮、胃、腸道、肌肉，其中肝臟SOD 活性顯著高于其他組織，而肌肉中SOD 活性顯著低于其他組織。不同年齡組大鯢特定組織中的SOD 活性也存在一定差異。除肌肉外，其他各組織1 齡組SOD 活性均高于2 齡組和3 齡組。

分別為印多爾：49%、密魯特：36%、德里：30%、那格浦爾：22%、孟買：18%、海德拉巴：11%、金奈：6%、加爾各答：4%。（數(shù)據(jù)來源：印度全國家庭健康調(diào)查）

1.3.2 過氧化氫酶（ Catalase CAT） 活性測定 其活性單位定義為:每克血紅蛋白中或每克組織蛋白中過氧化氫(CAT)每秒鐘分解吸光度為0.50 ～0.55 的底物中的過氧化氫相對量為一個(gè)過氧化氫酶的活力單位。

1.3.4 堿性磷酸酶（ AKP） 活性測定 其活力單位定義為:每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min 產(chǎn)生1 mg 酚為一個(gè)活力單位。

這些編碼方法具有一定的主觀性，但研究目的只是借波特一致性系數(shù)以說明標(biāo)準(zhǔn)與試卷a的一致性是否比試卷b好，編碼標(biāo)準(zhǔn)是一致的，能降低影響，當(dāng)然如果有更多的人參與到編碼中，可以降低主觀性.

1.3.3 谷胱甘肽過氧化物酶（ Glutathione peroxidase，GPx） 活性測定 其活性單位定義為:每毫克蛋白質(zhì)，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中GSH 濃度降低1 μmol/L 為一個(gè)酶活力單位。

1.3.5 酸性磷酸酶（ ACP） 活性測定 其活力單位定義為:每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用30 min 產(chǎn)生1 mg 酚為一個(gè)活力單位。

考慮到圖像內(nèi)外局部灰度的差異，我們提出了一種新的快速自適應(yīng)活動輪廓模型來解決這些限制，相比現(xiàn)有的模型，本文做出了以下貢獻(xiàn)：第一，本文首次將輪廓內(nèi)外局部灰度的差異加入至能量泛函，當(dāng)兩者灰度差異很大時(shí)，即演化曲線逼近圖像邊緣時(shí)，減緩曲線演化速度，反之，加速曲線演化；第二，本文應(yīng)用鄰域平均算子計(jì)算局部鄰域灰度均值，在表達(dá)局部圖像信息的同時(shí)，又對圖像進(jìn)行了一定的平滑，消除了部分噪聲和灰度不均勻?qū)Ψ指罱Y(jié)果的影響。第三，本文將內(nèi)外輪廓局部鄰域的勻質(zhì)性差異代替λ1、λ2作為內(nèi)、外局部能量參數(shù)值的控制項(xiàng)，解決了模型對參數(shù)敏感這一問題，同時(shí)還提高了曲線的演化效率。

1.1 一般資料 以2011年1月至2016年1月在伊犁哈薩克自治州友誼醫(yī)院行胸腰椎結(jié)核手術(shù)的186例患者為研究對象，回顧性收集其各項(xiàng)資料。其中，哈薩克族97例，其他民族89例；男112例，女74例；年齡25～56歲，平均(41.25±4.63)歲；129例患者病變累及1個(gè)或2個(gè)節(jié)段，57例患者病變累及3個(gè)及以上節(jié)段；病程2～27個(gè)月，平均(11.32±4.93)個(gè)月。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用spss13.0 對3 個(gè)年齡組不同組織免疫相關(guān)酶活性進(jìn)行顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年齡組大鯢組織中SOD 的分布及活性

5 種酶活性均采用購自南京建成生物有限公司的試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.6 蛋白測定 所有組織蛋白濃度均采用考馬斯亮蘭法測定，具體操作參照南京建成生物有限公司的試劑盒進(jìn)行。

橘紅是被迫走的，她并不想離開濱湖。楊琳說，橘紅和她分手告別時(shí)，流了眼淚。何牦只要站在臨湖廣場這個(gè)昔日的碼頭上，仿佛就看了橘紅流著兩串長長的淚水，依依不舍走向四層客輪。濱湖是她的傷心之地，為何還這樣依依不舍？對濱湖她有什么不舍？一定是為了他，為了他這個(gè)不爭氣的膽小男人。橘紅早預(yù)料到這一走難能相見。

圖1 SOD 在不同年齡組大鯢各組織中的分布及活性Fig.1 The separation and activities of SOD in Andrias davidianu at different ages

圖2 CAT 在不同年齡組大鯢各組織中的分布及活性Fig.2 The separation and activities of CAT in Andrias davidianu at different ages

圖3 GPx 在不同年齡組大鯢各組織中的分布及活性Fig.3 The separation and activities of GPx in Andrias davidianu at different ages

圖4 AKP 在不同年齡組大鯢各組織中的分布及活性Fig.4 The separation and activities of AKP in Andrias davidianu at different ages

圖5 ATP 在不同年齡組大鯢各組織中的分布及活性Fig.5 The separation and activities of ATP in Andrias davidianu at different ages大寫字母表示同一年齡組不同組織酶活力差異，小寫字母表示不同年齡組同一組織酶活力差異，相鄰字母表示差異顯著(P ＜0.05)，相間字母間表示差異極顯著(P ＜0.01)。Capital letters indicated enzyme activity of different tissues at the same age group，lowercase indicated enzyme activity of different age groups at the same tissue. Adjacent letters indicated difference(P ＜0.05)，interval letters indicated significantly difference(P ＜0.01).

2.2 不同年齡組大鯢組織中CAT 的分布及活性

3 個(gè)不同年齡組大鯢組織中CAT 活性分布如圖2 所示。從圖2 中可知，3 個(gè)年齡組的大鯢CAT 活性大小依次表現(xiàn)為表皮、肝臟、胃、腸道、肌肉，其中表皮和肝臟CAT 活性顯著高于其他組織，而肌肉中CAT 活性則顯著低于其他組織。不同年齡組大鯢特定組織中的CAT 活性也雖有一定差異，但未達(dá)到顯著程度，除肌肉外均呈現(xiàn)1 齡組活性均高于2 齡組和3 齡組。

1.3.1 超氧化物歧化酶（ Superoxide Dismutase SOD） 活性測定 其活性單位定義為:在30 ℃下，每毫克組織蛋白在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)到50%時(shí)所對應(yīng)的SOD 量為一個(gè)SOD 單位(U/mg protein)。

2.3 不同年齡組大鯢組織中GPx 的分布及活性

3 個(gè)不同年齡組大鯢組織中GPx 活性分布如圖3 所示。從圖3 中可知，3 個(gè)年齡組的大鯢GPx 活性大小依次表現(xiàn)為肝臟、表皮、腸道、胃、肌肉，其中肝臟GPx 活性顯著高于其他組織，而肌肉中GPx 活性顯著低于其他各組織。不同年齡組大鯢特定組織中的GPx 活性存在一定差異。例如3 齡大鯢肝臟中GPx 活性顯著高于1 齡和2 齡，而其他年齡組大鯢各組織GPx 活性卻未達(dá)到顯著差異程度。

2.4 不同年齡組大鯢組織中AKP 的分布及活性

3 個(gè)不同年齡組大鯢組織中AKP 活性分布如圖4 所示。從圖4 中可知，3 個(gè)年齡組的大鯢AKP 活性大小依次表現(xiàn)為表皮、肝臟、肌肉、腸道、胃，其中表皮中AKP 活性顯著高于其他組織。不同年齡組大鯢特定組織中的AKP 活性存在一定差異，且除腸道外均差異顯著。

2.5 不同年齡組大鯢組織中ATP 的分布及活性

3 個(gè)不同年齡組大鯢組織中ATP 活性分布如圖5 所示。從圖5 中可知，1 齡和3 齡組大鯢ATP 活性大小依次表現(xiàn)為肝臟、腸道、肌肉、胃、表皮，2 齡大鯢ATP 活性大小依次表現(xiàn)為腸道、肝臟、肌肉、胃、表皮，其中表皮中AKP 活性顯著低于其他組織。不同年齡組大鯢特定組織中的AKP 活性存在一定差異，除肝臟外均差異顯著。

3 討論

細(xì)胞代謝過程中會產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，在正常生長和代謝情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡。當(dāng)活性氧產(chǎn)生與清除失衡時(shí)，就導(dǎo)致氧化脅迫，活性氧使生物大分子、生物膜遭到可逆及不可逆損傷，嚴(yán)重時(shí)可引起細(xì)胞死亡［11］。生物體在長期的進(jìn)化過程中，形成了一套抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)多余的活性氧，包括非酶類抗氧化劑和酶類抗氧化劑，前者如維生素E、谷胱甘肽、β－胡蘿卜素等;后者主要有3 種:超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)。SOD 和CAT 是生物體細(xì)胞內(nèi)清除O2－等自由其以用分解H2O2的重要酶類，已有的研究表明這兩種酶的活性與生物體細(xì)胞免疫防御能力密切相關(guān)。因機(jī)體不同組織表現(xiàn)出的免疫功能有所不同，因此決定了SOD 和CAT 在機(jī)體各組織中表現(xiàn)出不同的活性，并隨著機(jī)體的生長活性也有所變化。李文英等［12］實(shí)驗(yàn)表明斑馬魚(Brachydanio rerio)不同組織中活性差別較肝臟和鰓中SOD 酶活性分別為(41.86 ±3.28)和(10.75 ±0.87)U/mg。盧彤巖［13］等報(bào)道了哲羅鮭(Hucho taimen)不同組織SOD和CAT 活性，表明CAT 和SOD 均在肝臟中表現(xiàn)為最高活性。王荻［14］等對小體鱘(Acipenser ruthenus)、西伯利亞鱘(Acipenser baerii Brandt)及雜交鱘I 和雜交鱘II 4 個(gè)群體的肝、腎、鰓、肌肉和血液組織中免疫相關(guān)的超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)的活性分布進(jìn)行了比較研究。本研究通過分析1齡、2 齡和3 齡大鯢5 種組織中SOD 和CAT 酶活力分布，發(fā)現(xiàn)SOD 在肝臟中活力最強(qiáng)，CAT 在表皮中活力最高，肝臟中其次，且隨著年齡的增長CAT 及SOD 活性下降。這表明肝臟和表皮是大鯢較為重要的免疫器官，尤其是在生長初期。隨著大鯢的生長和機(jī)體免疫系統(tǒng)的趨于完善，肝臟和表皮免疫功能逐步減弱。

磷酸酶是磷代謝過程中的重要酶類，在營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)過程中起重要作用，也是動物體內(nèi)重要的解毒體系［17］。堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ATP)作為2 種重要的機(jī)體功能調(diào)節(jié)酶，其活力是細(xì)胞和體液免疫的綜合體現(xiàn)，也是衡量免疫功能和機(jī)體狀態(tài)的指標(biāo)，反映了機(jī)體對外源微生物侵染的防御能力。沈國民［9］等分析了大鯢24 種組織堿性磷酸酶的特性，發(fā)現(xiàn)200 KD 和230 KD 的堿性磷酸酶在心臟活性最高。盧彤巖［13］等研究表明，AKP 和ATP 在不同大小哲羅魚組織內(nèi)表現(xiàn)活性不同。Broeg K［18］等認(rèn)為魚類肝臟巨噬細(xì)胞的吞噬活性高低可以以肝臟中酸性磷酸酶作為一個(gè)主要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，AKP 和ATP 在大鯢的各組織中均有一定的分布，但表現(xiàn)為不同的活力，且活性與年齡有不同的關(guān)系，這也說明AKP 與ATP 不僅與機(jī)體免疫相關(guān)，也參與了機(jī)體的生長代謝。

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