吳茱萸粉末醋調(diào)敷小鼠皮膚體外透皮吸收研究*

★ 歐水平 曹森 王森 雷小娟 袁濤 (.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 成都 60075)

吳茱萸粉末醋調(diào)敷小鼠皮膚體外透皮吸收研究*

★ 歐水平1,2曹森1王森1**雷小娟1袁濤1(1.江西中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 成都 610075)

目的：考察吳茱萸粉末醋調(diào)敷小鼠皮膚的體外透皮吸收特性。方法：采用改良的Franz擴(kuò)散池，以離體小鼠皮膚為透皮屏障，通過體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)，用高效液相色譜法檢測接收液和皮膚中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的質(zhì)量濃度，擬合滲透曲線方程，計(jì)算累積透過量、滲透速率、皮膚滯留量。結(jié)果：吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的透皮吸收速率分別為0.64、0.44、4.91μg/(cm2·小時)，24小時累積透過量分別為15.05±2.40、10.69±1.04、114.16±6.83μg/cm2，24小時滯留量分別為0.77±0.42、1.66±0.81、4.97±0.69μg/cm2。結(jié)論：吳茱萸粉末醋調(diào)敷小鼠皮膚，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯均可透皮吸收，為吳茱萸醋調(diào)敷外治法的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

吳茱萸；透皮吸收；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；吳茱萸內(nèi)酯

吳茱萸，粉末醋調(diào)外敷足心涌泉穴，取其滋陰降火、引熱下行，發(fā)揮藥物和穴位的雙重作用，用于降壓和改善高血壓癥狀，療效獨(dú)特[1]；研究表明，吳茱萸中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有降血壓的作用[2]；據(jù)文獻(xiàn)[3-5]報(bào)導(dǎo)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有一定的經(jīng)皮滲透性，本實(shí)驗(yàn)選取吳茱萸堿和吳茱萸次堿為指標(biāo)成分，首次研究吳茱萸藥材粉末醋調(diào)敷豚鼠體外透皮吸收特性，并建立透皮樣品的高效液相色譜分析方法，為吳茱萸經(jīng)皮給藥制劑的研究提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、色譜柱 Hypersil ODS2(5μm，4.6×250mm)(大連依利特，柱號：E2115011)、 TT-6B 透皮吸收試驗(yàn)儀(配套改良Franz擴(kuò)散池，S=1.7663cm2，V=12mL，天津市正通科技有限公司)、BP21ID Sartorius電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、KQ3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

吳茱萸堿對照品(批號：11802-200606)、吳茱萸次堿對照品(批號：11801-201006)均購于中國藥品生物制品檢定所。吳茱萸藥材(樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號：1105004)。乙腈、甲醇為色譜純，雙蒸水自制，其余試劑為分析純。山西陳醋為市售品(山西陳世家釀業(yè)有限責(zé)任公司 批號：2011/03/13)。

實(shí)驗(yàn)動物：小白鼠，雄性4只，體重18-20g，江西中醫(yī)學(xué)院動物中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 吳茱萸藥材前處理

將吳茱萸果實(shí)放入60℃烘箱中烘干至恒重，然后用藥材粉碎機(jī)將其粉碎成粉末，過篩，置干燥器中備用。

2.2 離體鼠皮的制備

將小鼠腹部毛小心剪去，處死后剪下腹部皮膚，小心剝離脂肪及粘液組織，選取完整皮膚，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，冰箱貯存，1周內(nèi)備用。

2.3 對照品溶液的配制

各取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯對照品約，精密稱定，分別加甲醇至mL定容，即得吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯對照品溶液母液，濃度分別為83.3、110.3、483.6μg/mL。

2.4 色譜條件

采用乙腈-水梯度洗脫，見表1，流速1.0mL/分、柱溫25℃、檢測波長225nm。

表1 梯度洗脫條件

2.5 吳茱萸藥材含量測定

取吳茱萸藥材粉末(過三號篩)約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25mL，稱定重量，浸泡1小時，超聲處理(功率100W，頻率40kHz)40分鐘，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液[6]，按4項(xiàng)下條件精密量取20μL進(jìn)樣測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯含量。

2.6 小鼠體外透皮吸收試驗(yàn)

采用改良Franz擴(kuò)散池，接收液為PEG400-95%乙醇-水(1∶3∶6)[4]。稱取1g 吳茱萸粉末(過120目篩)，用食醋3mL調(diào)成糊狀。將處理好的小鼠腹部皮膚3份，皮膚真皮面向接收池固定于擴(kuò)散裝置的擴(kuò)散室和接收室之間，在接收室中注滿接收液，排盡氣泡。磁力攪拌器轉(zhuǎn)速設(shè)定為350r/分，水浴溫度37℃±0.25℃，擴(kuò)散池容積12mL，有效擴(kuò)散面積為1.7663cm2。平衡半小時后，將上述吳茱萸糊緊密貼于皮膚表面，于1、2、4、8、12、24小時取樣，同時補(bǔ)充等量新鮮接受液取樣時將接收室中的液體全部倒出，經(jīng)微孔濾膜濾過，即得透皮吸收液樣品。平行a、b、c三組空白皮膚樣品1份，同法操作。透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚，用新鮮接收液清洗表面殘留物，濾紙吸干，剪碎后加入5mL甲醇超聲提取2次，每次30分鐘，取上清液用微孔濾膜濾過，得皮膚樣品?？瞻灼つw樣品1份同法操作。所得樣品按2.4項(xiàng)下條件精密量取20μL進(jìn)樣測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 藥材有效成分含量

吳茱萸藥材中3種主成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為0.779%、0.553%、1.300%，符合藥典規(guī)定。

3.2 體外經(jīng)皮滲透性

藥物的累積透皮量Qn可由式1計(jì)算[7]：

其中，A為有效擴(kuò)散面積，V為接受液總體積，Cn為第n次取樣時接受液中藥物的質(zhì)量濃度，Ci為第i次取樣時接受液中藥物的質(zhì)量濃度，Vi為取樣體積。以藥物的累積透過量Qn(μg/cm2)對取樣時間t作曲線(見圖1)，并由公式(2)對曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js (μg/(cm2·小時))，直線與x軸的交點(diǎn)為時滯tlag (小時)。

藥物的皮膚滯留量QS (μg/cm2)可由式3計(jì)算:

其中，A為有效擴(kuò)散面積，V為皮膚提取液總體積，C為皮膚提取液中藥物的濃度。

吳茱萸醋調(diào)敷小鼠透皮成分經(jīng)皮滲透性結(jié)果如下：

表2 體外透皮吸收結(jié)果

圖1 吳茱萸粉末醋調(diào)敷小鼠皮膚有效成分滲透曲線

4 小結(jié)與討論

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，指標(biāo)成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯透皮過程的線性規(guī)律明顯，透皮速率恒定，符合零級模型，滿足制成透皮制劑的前提條件。而本實(shí)驗(yàn)中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的透皮吸收速率較小[8]，而且24小時累積透過量分別占藥材含量的1.4%和1.1%，說明皮膚屏障限制了藥物的透皮吸收，提示采用各種方法或手段促進(jìn)有效成分的透皮吸收是提高吳茱萸透皮制劑血藥濃度的關(guān)鍵。

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[9]及透皮樣品在紫外-可見分光亮度計(jì)在200-400nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在225nm處有較大的紫外吸收，并且對目標(biāo)成分的選擇性更好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇225nm做為檢測波長。并且本實(shí)驗(yàn)也優(yōu)化了流動相比例，使其洗脫能力更強(qiáng)，吳茱萸堿和吳茱萸次堿都能獲得基線分離。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，透皮樣品中吳茱萸生物堿成分性質(zhì)不穩(wěn)定，對光和熱敏感，試驗(yàn)過程中易被破壞，導(dǎo)致含量測定時不易被檢出，不能長期保存，與文獻(xiàn)[10]報(bào)導(dǎo)一致，樣品應(yīng)放在陰涼避光處保存，并在短期內(nèi)完成檢測。應(yīng)進(jìn)一步研究生物堿成分不穩(wěn)定的原因，以科學(xué)地指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

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江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：2010JX00095)；南昌市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：2010-KJZCJH-YYYYLQX-108)；江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：YC2011-S111)。

**通訊作者：王森,Tel：0791-87118614，E-mail：wangsen912912@126.com。

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2013-05-17)