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    紫草素對(duì)淋巴瘤治療作用研究

    2013-11-04 07:09:34翟月
    中國(guó)科技信息 2013年14期

    翟月

    四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041

    B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤是一種發(fā)病率較高,但目前治療效果不理想的腫瘤疾病[1]。紫草素作為紫草有效成分之一,在抗炎、抗微生物及抗腫瘤等作用受到人們關(guān)注。其中,紫草素作為抗腫瘤藥物,效能高,腫瘤耐藥性低[2]。Rajasekar S等人報(bào)道紫草素具有抗皮膚癌作用[3]。同時(shí),紫草素可以抑制人類結(jié)直腸癌細(xì)胞在體內(nèi)外的生長(zhǎng)[4]。另外,紫草素可以通過(guò)活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[5]。除了可以直接引起腫瘤細(xì)胞免疫原性的死亡,紫草素也能夠增強(qiáng)基于樹(shù)突細(xì)胞腫瘤疫苗的作用[6],或是通過(guò)誘導(dǎo)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)因子(Regulated on Activation,Normal T cell Expressed and Secreted,RANTES),增強(qiáng)基于基因表達(dá)的腫瘤疫苗[7]。然而,紫草素在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的治療作用并不明確。本實(shí)驗(yàn)以人Raji細(xì)胞,即B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞作為對(duì)象,研究紫草素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡能力,進(jìn)一步了解紫草素對(duì)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的抑制作用。

    1.方法

    1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    人Burkitt’s 淋巴瘤 Raji細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC)。Raji細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng),每2d換一次液。

    1.2 PI染色檢測(cè)細(xì)胞死亡

    105個(gè)/mL細(xì)胞1mL接種于12孔板,分別做對(duì)照組(CTL),紫草素組(SHK),。對(duì)照組加入1.0μLDMSO,SHK組加入10μmolL-1紫草素,孵育6h。處理完成的細(xì)胞1 000 r/min離心5 min,棄去上清。用4 ℃ 預(yù)冷的PBS洗3 次,1 000 r/min 離心5min,去上清,用100 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,加入5μL 的碘化丙啶(PI)溶液;混勻后于室溫避光孵育15 min;在反應(yīng)管中加入400 μL PBS,流式細(xì)胞儀分析。

    1.3 中性紅檢測(cè)細(xì)胞存活率

    中性紅可以被活細(xì)胞攝入后累積在溶酶體中,活細(xì)胞增多時(shí)攝入的中性紅量增加,而細(xì)胞活性下降或細(xì)胞數(shù)減少時(shí)攝入的中性紅會(huì)減少。因此,通過(guò)將5*105個(gè)/mL細(xì)胞1mL接種于12孔板,分別加入不同濃度的紫草素(0μmol·L-1,1.25μmol·L-1,2.5μmol·L-1,5μmol·L-1,10μmol·L-1,20μmol·L-1,40μmol·L-1及80μmol·L-1),孵育6h。紫草素誘導(dǎo)后,先用無(wú)菌PBS適當(dāng)溶液洗滌2次,隨后600μl細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,每孔加入60μl中性紅染色液,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)。2小時(shí)后去除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗滌1-2次。加入200微升中性紅檢測(cè)裂解液,室溫?fù)u床上裂解10分鐘。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的A540,690nm作為參考波長(zhǎng)[8]。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,借助GraphPad Prism5軟件進(jìn)行作圖。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 ±SD表示.其中統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)以不同實(shí)驗(yàn)組與最對(duì)照組分別比較,采用t檢驗(yàn)。p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    2.結(jié)果分析

    2.1 紫草素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡

    PI單染熒光顯微鏡分析結(jié)果如圖1所示,右圖加入紫草素的實(shí)驗(yàn)組中PI單陽(yáng)細(xì)胞,即死亡細(xì)胞數(shù)目明顯多于左圖實(shí)驗(yàn)組。由此可得出紫草素能夠誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生死亡。

    圖1:紫草素對(duì)Raji細(xì)胞死亡的影響熒光顯微鏡下Raji細(xì)胞死亡情況,左圖為對(duì)照組,右圖為實(shí)驗(yàn)組。

    2.2 紫草素誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡呈濃度依賴

    紫草素對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用如圖3所示。中性紅細(xì)胞存活率檢測(cè)(圖2)可知,隨著藥物濃度增大(0μmol·L-1,1.25μmol·L-1,2.5μmol·L-1,5μmol·L-1,10μmol·L-1,20μmol·L-1,40μmol·L-1及80μmol·L-1),紫草素對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)。以上實(shí)驗(yàn)證明紫草素可誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡,并呈濃度依賴。

    圖2 不同濃度紫草素對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

    中性紅染色檢測(cè)不同濃度紫草素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。*表示p<0.05,**表示p<0.01。

    3.討論

    紫草素作為一種植物提取物,具有多種生物學(xué)功能,尤其是其腫瘤抑制作用受到廣泛認(rèn)可。紫草素抗腫瘤作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明,紫草素可以抑制Raji細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,誘導(dǎo)Raji細(xì)胞死亡,并呈濃度依賴。這提示紫草素在非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤的治療中有重要作用。但紫草素治療腫瘤的機(jī)制,尤其是其誘導(dǎo)死亡的類型還有待進(jìn)一步研究。盡管紫草素對(duì)于許多疾病來(lái)說(shuō)是一種治療作用顯著的藥物,但其毒性不可忽視,合理規(guī)范的使用紫草素十分重要。

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