非那雄胺對(duì)糖尿病小鼠腎小球微血管密度及VEGF表達(dá)的影響

田河林，許忠新，韋立順，康艷輝，趙如同，金東嶺

糖尿病微血管病變是糖尿病的常見并發(fā)癥，而異常血管新生在糖尿病微血管病變的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]。微血管密度(microvessel density，MVD)是反映血管生成的生物指標(biāo)，CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，是目前檢測(cè)微血管的可靠標(biāo)記[2]。非那雄胺是一種5α還原酶抑制劑，臨床用于良性前列腺增生癥(benign prostate hyperplasia，BPH)的治療。臨床研究發(fā)現(xiàn)，非那雄胺可減少前列腺經(jīng)尿道切除術(shù)患者的出血量，緩解BPH血尿癥狀，該作用可能與其抑制前列腺組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)、降低MVD有關(guān)[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非那雄胺可抑制早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)并降低MVD[4]。但有關(guān)非那雄胺對(duì)糖尿病腎臟MVD及VEGF表達(dá)的影響，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，應(yīng)用免疫組化方法觀察CD34及VEGF在糖尿病小鼠腎小球的表達(dá)，探討非那雄胺對(duì)糖尿病小鼠腎小球MVD的影響，旨在為研究非那雄胺對(duì)血管新生的作用及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 鏈脲佐菌素(Alexis公司)；非那雄胺(杭州默沙東制藥有限公司)；VEGF單抗、CD34單抗、SP檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。血糖儀及血糖試紙購自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。CX41型顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠35只，雄性，體重30～35g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(冀)2008-1-008。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物禁食12h后，一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(pH4.4檸檬酸緩沖液配制)150mg/kg制備糖尿病模型。60h后，小鼠禁食(不禁水)12h，尾靜脈取血測(cè)空腹血糖，空腹血糖高于16.7mmol/L為造模成功[5]。將糖尿病模型小鼠按血糖值隨機(jī)分為4組，即模型組和非那雄胺0.1、1、10mg/kg組，每組7只；另取7只正常小鼠作為對(duì)照組。非那雄胺組小鼠每日分別給予非那雄胺0.1、1、10mg/kg灌胃，對(duì)照組和模型組小鼠給予等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

1.3 標(biāo)本處理 末次給藥后，小鼠禁食(不禁水)12h，稱空腹體重，測(cè)空腹血糖。腹腔注射烏拉坦1g/kg麻醉，摘取腎臟，以10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片，行HE染色。CD34及VEGF染色采用免疫組化SP法，操作步驟按SP試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果觀察 取HE染色切片進(jìn)行腎臟形態(tài)學(xué)觀察，采用組織細(xì)胞病理分析軟件在400倍視野下測(cè)量腎小球面積(Ga)，根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法計(jì)算腎小球體積(Gv)。Gv＝β/k×(Ga)3/2，其中β＝1.38(形態(tài)系數(shù))，k＝1.1(大小分布系數(shù))。每張切片隨機(jī)測(cè)定5個(gè)不重復(fù)腎小球，取其平均值。血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為CD34染色陽性，單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇染色陽性判定為一個(gè)微血管[3]。在400倍視野下每張切片隨機(jī)測(cè)5個(gè)不重復(fù)腎小球，取其平均值作為MVD值。細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF表達(dá)陽性。按細(xì)胞染色強(qiáng)度(a)計(jì)分：淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；同時(shí)按顯色細(xì)胞百分比(b)計(jì)分：≤30%細(xì)胞顯色1分，31%～60%細(xì)胞顯色2分，≥61%細(xì)胞顯色3分。將2項(xiàng)得分的積作為VEGF表達(dá)指數(shù)(VEGF index)，即VEGF指數(shù)＝a×b[7]。在400倍視野下觀察，每張切片隨機(jī)取5個(gè)腎小球，取其平均值作為VEGF指數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均以s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重及血糖水平比較 與治療前比較，4周后對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常，體重增加(P＜0.05)，空腹血糖值無顯著變化(P＞0.05)，模型組和非那雄胺各劑量組小鼠空腹血糖值明顯升高(P＜0.01)，體重有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。4周后，與對(duì)照組比較，模型組和非那雄胺各劑量組小鼠活動(dòng)減少，體重顯著降低(P＜0.01)，空腹血糖值明顯升高(P＜0.01)，而與模型組比較，非那雄胺各劑量組小鼠體重和血糖值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。

2.2 各組腎小球組織形態(tài)學(xué)變化 腎臟病理檢查顯示，對(duì)照組小鼠腎小球、細(xì)胞外基質(zhì)及腎小管未見異常；模型組小鼠腎小球明顯增大，腎小球毛細(xì)血管數(shù)目增多，細(xì)胞外基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞水腫，管腔擴(kuò)張；非那雄胺0.1mg/kg和1mg/kg組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)與模型組比較無明顯差異，非那雄胺10mg/kg組小鼠腎臟病變程度略輕于模型組(圖1)。組織細(xì)胞計(jì)量學(xué)測(cè)定結(jié)果顯示，模型組及非那雄胺各劑量組小鼠腎小球面積及體積均顯著大于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)；與模型組比較，非那雄胺0.1mg/kg和1mg/kg組腎小球面積及體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但非那雄胺10mg/kg組小鼠腎小球面積及體積顯著減小(P＜0.01，P＜0.05，表2)。

表1 各組體重與血糖變化(s, n=7)Tab. 1 Changes of body weight and blood glucose level in different groups s, n=7)

表1 各組體重與血糖變化(s, n=7)Tab. 1 Changes of body weight and blood glucose level in different groups s, n=7)

(1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.05, (3)P＜0.01 compared with 0 week

Group Body weight(g) Blood glucose (mmol/L)0 week 4 week 0 week 4 week Control 37.2±2.7 41.5±2.9(2) 6.6±1.5 7.3±2.2 Diabetic model 36.7±2.6 35.0±2.7(1) 19.6±2.3(1) 27.5±2.5(1)(3)Finasteride 0.1mg/kg 35.9±2.3 34.5±2.7(1) 19.4±2.6(1) 25.6±2.6(1)(3)Finasteride 1.0mg/kg 37.0±2.6 35.2±3.0(1) 20.1±2.8(1) 26.4±2.3(1)(3)Finasteride 10mg/kg 36.5±2.7 34.2±2.6(1) 19.8±2.7(1) 26.7±2.4(1)(3)

圖1 腎小球組織形態(tài)學(xué)變化(HE ×400)Fig. 1 Histomorphologic changes of glomeruli in mice (HE ×400)

表2 各組腎小球面積和體積變化(s, n=7)Tab. 2 Changes of glomerular area and volume in glomeruli, n=7)

表2 各組腎小球面積和體積變化(s, n=7)Tab. 2 Changes of glomerular area and volume in glomeruli, n=7)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.05,(4)P＜0.01 compared with diabetic model group

Glomerular volume(μm3, ×103)Control 2.0±0.6 116.6±52.8 Diabetic model 5.0±1.0(2) 455.9±137.2(2)Finasteride 0.1mg/kg 5.1±0.7(2) 457.1±89.3(2)Finasteride 1.0mg/kg 4.5±0.8(2) 397.7±91.0(2)Finasteride 10mg/kg 3.3±0.9(1)(4) 270.2±104.0(1)(3)Group Glomerular area(μm2, ×103)

2.3 各組腎小球MVD及VEGF表達(dá) 免疫組化染色顯示，與對(duì)照組比較，模型組及非那雄胺各劑量組小鼠腎小球CD34染色明顯增強(qiáng)；VEGF染色陽性細(xì)胞主要集中在腎小球，與對(duì)照組比較，模型組和非那雄胺各劑量組小鼠腎小球VEGF陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖2)。模型組和非那雄胺各劑量組小鼠腎小球MVD、VEGF指數(shù)均高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)；與模型組比較，非那雄胺0.1mg/kg和1mg/kg組小鼠腎小球MVD、VEGF指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，非那雄胺10mg/kg組小鼠腎小球MVD、VEGF指數(shù)明顯降低(P＜0.05，表3)。

表3 腎小球MVD及VEGF表達(dá)變化(x±s, n=7)Tab. 3 Changes of MVD and VEGF expression in glomeruli n=7)

表3 腎小球MVD及VEGF表達(dá)變化(x±s, n=7)Tab. 3 Changes of MVD and VEGF expression in glomeruli n=7)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.05 compared with diabetic model group

Group MVD VEGF index Control 14.5±2.7 2.3±1.3 Diabetic model 22.6±2.5(2) 6.6±1.6(2)Finasteride 0.1mg/kg 21.2±1.7(2) 6.1±1.1(2)Finasteride 1.0mg/kg 20.8±1.9(2) 5.8±1.2(2)Finasteride 10mg/kg 19.1±2.3(2)(3) 4.5±1.4(1)(3)

3 討 論

圖2 腎小球CD34及VEGF的表達(dá)(SP ×400)Fig. 2 Expression of CD34 and VEGF in glomeruli of mice (SP ×400)

目前認(rèn)為，有多種因素參與了糖尿病微血管病變的發(fā)生發(fā)展過程，如生化代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、細(xì)胞因子分泌增多等，但糖尿病微血管病變的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。糖尿病動(dòng)物模型的建立為研究糖尿病微血管病變發(fā)病機(jī)制及藥物療效評(píng)價(jià)提供了方便。鏈脲佐菌素對(duì)動(dòng)物胰島β細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，可特異性作用于胰島β細(xì)胞并破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰島素分泌障礙，誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型形成。本實(shí)驗(yàn)采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，成模后小鼠血糖升高，體重減輕，并伴有多食、多飲、多尿癥狀，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)成模小鼠出現(xiàn)了早期腎臟病變，包括腎小球肥大，細(xì)胞外基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞水腫，管腔擴(kuò)張等，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道結(jié)果相符。

研究表明，異常血管新生與腎小球肥大、腎間質(zhì)損害及尿蛋白排泄增多有關(guān)，而抑制血管新生則可改善糖尿病腎臟病變[9-11]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠腎小球CD34表達(dá)明顯增強(qiáng)，腎小球MVD顯著高于對(duì)照組；相似研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠3周時(shí)，其腎小球CD31(另一種血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多[11]。上述結(jié)果表明，早期糖尿病小鼠腎小球已出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、毛細(xì)血管數(shù)增多等變化，提示糖尿病早期腎小球已存在異常血管新生?，F(xiàn)有資料表明，異常血管新生是導(dǎo)致糖尿病腎臟病變的主要原因。高糖、缺氧、糖基化終末產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等多種因素促進(jìn)了腎臟VEGF的合成與分泌，VEGF表達(dá)上調(diào)最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和病理性血管新生[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病小鼠給予非那雄胺10mg/kg連續(xù)灌胃4周，其腎小球MVD及VEGF指數(shù)明顯低于模型組，提示非那雄胺對(duì)糖尿病早期小鼠腎小球新生血管形成具有抑制作用。臨床資料顯示，非那雄胺可降低BPH患者前列腺尿道黏膜下MVD，且該作用與非那雄胺對(duì)此部位VEGF表達(dá)的抑制呈正相關(guān)[7,13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型中，非那雄胺與阿卡波糖聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜MVD，并可抑制VEGF在視網(wǎng)膜的表達(dá)，而單用阿卡波糖則無此作用[4]?？梢?，非那雄胺對(duì)不同組織新生血管形成具有抑制作用，該作用與其抑制VEGF在組織中的表達(dá)有關(guān)。血管新生是多種因素相互作用的結(jié)果，VEGF是其中的重要因素之一。但非那雄胺抑制血管新生的確切機(jī)制尚在進(jìn)一步研究之中。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，非那雄胺可降低VEGF在糖尿病小鼠腎小球中的表達(dá)，降低腎小球MVD，抑制糖尿病所致腎小球新生血管形成，對(duì)糖尿病腎微血管病變具有潛在防治作用。

[1]Yu P, Li Q, Liu Y, et al. The changes of endothelial function of blood vessels in early diabetic nephropathy[J]. Chin J Pract Inter Med, 2010, 30(9):827-828. [于萍, 李強(qiáng), 劉穎, 等. 2型糖尿病早期血管內(nèi)皮功能變化的研究[J]. 中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2010, 30(9):827-828.]

[2]Acevedo LM, Londono I, Oubaha M, et al. Glomerular CD34 expression in short- and long-term diabetes[J]. J Histochem Cytochem, 2008, 56(6): 605-614.

[3]Memis A, Ozden C, Ozdal OL, et al. Effect of finasteride treatment on suburethral prostatic microvessel density in patients with hematuria related to benign prostate hyperplasia[J]. Urol Int, 2008, 80(2): 177-180.

[4]Dai XQ, Liu SS, Ni GB, et al. Effects of finasteride on expression of vascular endothelial growth factor and microvascular density in retina of early diabetic rats[J]. Chin J New Drugs Clin Rem,2004, 23(4): 199-202. [戴曉秦, 劉樹碩, 倪桂寶, 等. 非那雄胺對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和微血管密度的干預(yù)[J]. 中國新藥與臨床雜志, 2004, 23(4): 199-202.]

[5]Bai H, Ma XY, Guo AT, et al. The study on complete Freud's adjuvant of prevention of STZ-induced diabetes[J]. Med J Chin PLA, 2008, 33(6): 712-714. [白樺, 馬學(xué)毅, 郭愛桃. 完全弗氏佐劑預(yù)防鏈尿菌素引起糖尿病的機(jī)制研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 33(6): 712-714.]

[6]De Vriese AS, Tilton RG, Elger M, et al. Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes[J]. J Am Soc Nephrol,2001, 12(5): 993-1000.

[7]Pareek G, Shevchuk M, Armenakas NA, et al. The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density: a possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients[J]. J Urol, 2003,169(1): 20-23.

[8]Zhang HJ, Zhao JB, Li P. Progress in the study on animal model of diabetic nephropathy[J]. Chin Pharmacol Bull, 2008, 24(7):845-848. [張浩軍, 趙靜波, 李平. 糖尿病腎病動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2008, 24(7): 845-848.]

[9]Osterby R, Bangstad HJ, Nyberg G, et al. On glomerular structural alterations in type 1 diabetes: companions of early diabetic glomerulopathy[J]. Virchows Arch, 2001, 438(2): 129-135.

[10]Ichinose K, Maeshima Y, Yamamoto Y, et al. Antiangiogenic endostatin peptide ameliorates renal alterations in the early stage of a type 1 diabetic nephropathy model[J]. Diabetes, 2005,54(10): 2891-2903.

[11]Yamamoto Y, Maeshima Y, Kitayama H, et al. Tumstatin peptide,an inhibitor of angiogenesis, prevents glomerular hypertrophy in the early stage of diabetic nephropathy[J]. Diabetes, 2004,53(7):1831-1840.

[12]Khamaisi M, Schrijvers BF, De Vriese AS, et al. The emerging role of VEGF in diabetic kidney disease[J]. Nephrol Dial Transplant, 2003, 18(8): 1427-1430.

[13]Lekas AG, Lazaris AC, Chrisofos M, et al. Finasteride effects on hypoxia and angiogenetic markers in benign prostatic hyperplasia[J]. Urology, 2006, 68(2): 436-441.