黃體酮對海水浸泡腹部開放傷大鼠胃黏膜損傷的保護作用

浦江，崔立紅，劉超群，吳姍珊，李欣，李輝，羅哲

腹部開放傷海水浸泡是現(xiàn)代海戰(zhàn)中較為常見的傷型。海水具有高滲、高鈉、低溫的特點并含有多種細菌，海水進入受傷腹腔后機體會產生強烈的應激反應，釋放大量炎癥介質，胃黏膜上皮細胞出現(xiàn)壞死，凋亡增加，導致胃屏障功能障礙[1]。本研究以大鼠腹部開放傷合并海水浸泡為模型，觀察黃體酮對胃黏膜破壞、炎性反應及細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 雄性Wistar大鼠30只，清潔級，體重180～220g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。羊抗大鼠caspase-3多克隆抗體(一抗)由美國SantaCruz生物工程公司提供；TUNEL檢測試劑盒由德國Roche公司提供；鼠抗羊FITC-IgG二抗由北京中杉生物公司提供；黃體酮注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司。配方海水按國家海洋局第三研究所提供的人工海水配方配制。

1.2 動物模型制備 實驗前動物禁食12h，自由飲水，以鹽酸氯胺酮(10mg/kg)和速眠新(1ml/kg)配成麻醉劑，腹腔注射麻醉大鼠，取腹部正中縱行切口，長2～3cm，將浸泡于0.19%氯化鈉溶液的塑料網片置入腹腔內，以手術圓針帶線縫于腹壁上，防止浸泡過程中腸管擠出腹腔外。

1.3 動物分組及給藥方法 將30只實驗動物編號，利用隨機數字表法分成3組，每組10只。A組：腹部開放傷+滅菌注射用水皮下注射；B組：腹部開放傷海水浸泡+滅菌注射用水皮下注射；C組：腹部開放傷海水浸泡+黃體酮治療。A組大鼠開腹后敞開腹腔并浸入0.19%氯化鈉溶液中浸泡；B、C組大鼠于開腹后敞開腹腔并浸入海水中浸泡。浸泡后1、6、12h按16mg/kg劑量分別于皮下注射滅菌注射用水或黃體酮。16h后處死全部大鼠。

1.4 方法

1.4.1 胃黏膜損傷情況觀察 大鼠達到浸泡時限1h后迅速處死，標本取出后立即沿胃大彎側剪開胃壁使黏膜面外翻，用冷生理鹽水沖洗黏膜面血跡，將黏膜面向上平展于紗布上，在10倍放大鏡下用游標卡尺測量胃黏膜損傷情況。按Guth等[2]的標準評分：點狀病變?yōu)?分；病變長度＜1mm為2分；1～2mm為3分；2～4mm為4分；病變＞4mm為5分；病灶寬度＞1mm時分值×2。所有分值相加即為此只大鼠胃黏膜潰瘍指數(ulcer index，UI)。

1.4.2 光鏡下胃黏膜病理學觀察 于胃黏膜損傷最明顯處取胃組織0.5cm×1.0cm，置入4%甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色，行光鏡病理檢查。積分方法：對每張切片隨機選取5個視野，每個視野按病變嚴重程度分級：0=正常，1=上皮細胞損傷和腺體破壞，2=黏膜的出血性損傷和不超過黏膜下層的壞死，3=超過黏膜下層的壞死和潰瘍。5個視野得分累計為其組織學損傷積分。

1.4.3 胃黏膜炎癥介質水平測定 將剪為1～2cm長短的胃體小彎用鹽水沖洗，濾紙拭干稱重，在冰水環(huán)境下用生理鹽水和勻漿器制作成2～3ml胃黏膜組織勻漿，在4℃低溫離心機離心15min后，收集上清液，按照試劑盒說明書應用酶聯(lián)免疫法測定TNF-α、IL-6水平。

1.4.4 Caspase-3蛋白表達的免疫組化檢測 采用EnVision二步法，經脫蠟，水化，3%H2O2處理去除內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽溶液高壓修復抗原；滴加羊抗大鼠caspase-3多克隆抗體(1:100)，4℃過夜；滴加聚合物增強劑(試劑A)，37℃ 20min；滴加辣根過氧化物酶標記的鼠抗羊FITC-IgG二抗(試劑B)；DAB顯色；鏡下控制反應時間不超過5min，雙蒸水終止反應；蘇木素輕度復染，脫水、透明、封固、顯微鏡觀察。caspase-3蛋白表達量以其陽性細胞在胃黏膜上皮細胞中的百分比表示。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4.5 TUNEL法檢測凋亡細胞 采用TUNEL法原位標記DNA片段檢測凋亡細胞，全部程序按試劑盒提供的操作手冊進行，DAB顯色。TUNEL陽性細胞為棕色。每片選5個高倍(×400)陽性視野，根據多媒體病理圖像分析軟件(Olympus公司)計數每個視野中的陽性細胞數。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用x±s表示，組間均數比較采用Chisequare檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 胃黏膜病理學變化 光鏡下病理學觀察顯示，海水浸泡腹部開放傷大鼠部分胃絨毛頂端脫落，血管擴張、充血，小血管內見較多嗜中性粒細胞聚集，隱窩細胞變性壞死，大多數胃黏膜病理損傷加重。應用黃體酮后，從病理改變上看上述情況均明顯好轉，黏膜下層和肌層水腫、出血減輕，黏膜層有移行修復表現(xiàn)，但少數黏膜全層壞死者，黏膜層病變改善不明顯。

2.2 胃黏膜UI、組織學損傷積分及炎癥介質水平測定 B組大鼠UI、黏膜組織學損傷積分與A組比較明顯增加(P＜0.01)，C組與B組比較則明顯降低(P＜0.05，表1)。B組大鼠胃黏膜組織勻漿TNF-α、IL-6濃度與A組比較均明顯升高(P＜0.01)，C組與B組比較則顯著下降(P＜0.05，表1)。

2.3 Caspase-3蛋白表達比較 Caspase-3陽性細胞為棕黃色顆粒，表達于細胞質。正常大鼠胃黏膜組織中，可見胞質內棕黃色顆粒樣物質呈散在分布。B組caspase-3蛋白表達(23.8%±3.5%)與A組(10.2%±1.6%)比較明顯增加(P＜0.01)；C組(17.1%±2.3%)與B組比較則明顯下降(P＜0.05)。

表1 胃黏膜潰瘍指數、組織學損傷積分及炎癥介質水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of ulcer index, injury scales and inflammatory mediators of gastric mucosa s,n=10)

表1 胃黏膜潰瘍指數、組織學損傷積分及炎癥介質水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of ulcer index, injury scales and inflammatory mediators of gastric mucosa s,n=10)

(1)P＜0.01 compared with A group; (2)P＜0.05 compared with B group

Group Ulcer index Injury scales TNF-α(μg/L) IL-6(ng/L)A 0.4±0.09 2.4±0.85 0.4±0.05 260±12.14 B 1.8±0.12(1) 5.0±0.78(1) 1.3±0.15(1) 620±18.36(1)C 1.4±0.15(2) 4.4±0.43(2) 1.1±0.09(2) 494±14.20(2)

2.4 凋亡細胞檢測 經TUNEL染色，陽性物質呈棕黃色，主要位于細胞核內，常聚集于核膜附近或核質呈現(xiàn)均勻染色。B組凋亡細胞百分比(26.4%±2.8%)與A組(8.5%±1.5%)比較顯著增高(P＜0.01)，C組(19.8%±2.4%)與B組比較則明顯下降(P＜0.05)。

3 討 論

腹部開放傷海水浸泡后大鼠胃黏膜功能的主要變化包括應激性潰瘍、胃動力障礙、胃黏膜屏障破壞以及胃黏膜吸收功能的改變等四個方面[3]。外傷、休克均可導致胃黏膜炎性介質過量生成，胃黏膜通透性增加。以往研究表明，腹部開放傷海水浸泡能夠導致機體炎癥因子水平異常增高，胃黏膜形態(tài)破壞，胃黏膜上皮細胞過度凋亡等[1,3-4]。

研究表明，孕激素在改善心肌細胞損傷及凋亡、腸道黏膜組織損傷、大腦組織炎癥反應及功能恢復等方面有一定作用[5]，且女性比男性對于機體損傷具有更好的耐受性，女性海戰(zhàn)傷傷員的全身臟器損傷程度比男性輕微[5]。皮質類固醇能有效緩解潰瘍性結腸炎等炎癥性腸病的腸道黏膜損傷，但其導致的繼發(fā)細菌感染、骨質疏松等不良反應較為嚴重。與皮質類固醇相比，黃體酮不良反應較小。本研究觀察黃體酮對腹部開放傷海水浸泡大鼠胃黏膜上皮的形態(tài)、炎性介質水平、上皮細胞凋亡等的影響。

腹部開放傷海水浸泡后胃黏膜上皮細胞顯著凋亡可能是導致胃黏膜損傷的原因之一[1-2]。相關研究顯示，腹部開放傷經海水浸泡后，胃黏膜炎性介質、黏附因子釋放增加，中性粒細胞、單核細胞在胃黏膜組織聚集等因素都加劇了胃黏膜的炎性反應，造成胃黏膜結構顯著損傷[5]。本研究表明，黃體酮能調節(jié)胃黏膜炎性細胞因子水平，降低海水浸泡后腹部開放傷大鼠胃黏膜組織的TNF-α和IL-6水平，降低潰瘍指數及組織損傷程度。

本研究還顯示，腹部開放傷經海水浸泡后，大鼠胃黏膜上皮細胞大量凋亡，caspase-3表達明顯增加，表明腹部開放傷海水浸泡可以嚴重影響胃黏膜上皮細胞的凋亡狀況，打破胃黏膜上皮細胞正常的增殖與凋亡比例，破壞胃黏膜內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，影響胃黏膜的正常結構從而導致功能障礙。經黃體酮處理后，腹部開放傷海水浸泡大鼠TUNEL陽性的凋亡細胞明顯減少，caspase-3表達下降，有利于胃黏膜上皮層結構的維持及修復。

綜上所述，本研究表明黃體酮能抑制腹部開放傷海水浸泡大鼠胃黏膜的炎性反應，保護其胃黏膜上皮的組織結構，減少胃黏膜細胞的凋亡發(fā)生，減少應激性潰瘍及上消化道出血的發(fā)生概率，為海水浸泡腹部開放傷傷員的早期救治提供了可能。

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