納米銀溶膠的制備及其與熒光素相互作用的研究

劉征原，廉志紅，張鐵莉，于 翠

（1.河北聯(lián)合大學 材料科學與工程學院，河北 唐山 063009；2.唐山師范學院 化學系，河北 唐山 063000）

納米粒子是指直徑在1-100 nm之間的粒子，也稱為超微粒子。納米粒子具有小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應和宏觀隧道效應，因而顯示出不同于常規(guī)材料的熱、光、電、磁、催化等效應[1]。金屬納米粒子的表面等離子體共振可以極大地增強粒子周圍的電磁場，這種局域場可以改變吸附于其表面周圍的熒光體的自由空間條件，使其熒光增強或猝滅[2]。金屬納米材料以貴金屬金、銀、銅為代表，其中納米銀粒子在表面增強拉曼光譜、表面增強共振散射光譜、分子生物學、超分子體系等研究領(lǐng)域占有極為重要的地位[3]。納米銀溶膠的制備方法有多種，最常用的方法是化學還原法[4,5]。本文首次以太陽為光源，以聚乙烯吡咯烷酮為保護劑，用檸檬酸三鈉還原硝酸銀，制備了兩種顏色的納米銀溶膠，這種制備方法克服了其他光化學還原法需要特定的光源及特制反應器的限制[6-8]。

熒光素（fluorescein，F(xiàn)L）[9]因具有較高的熒光量子產(chǎn)率而被廣泛應用于 DNA雜化、生物分子的檢測等方面。高濃度時 FL易發(fā)生熒光自猝滅，因此作為熒光標記物使用時，須控制在較低濃度范圍內(nèi)，但因熒光強度弱而給檢測帶來困難。在 FL體系中引入金屬納米結(jié)構(gòu)，可以利用納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的強局域場使其熒光增強[10,11]。Malicka等[10]以 FL為熒光探針在銀島膜上進行熒光素標記 DNA的研究，發(fā)現(xiàn)FL熒光強度提高了7倍。金屬納米結(jié)構(gòu)的能量傳輸性質(zhì)決定于光輻射與納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的局域電磁場狀態(tài)，而后者與納米材料的顯微結(jié)構(gòu)、幾何狀態(tài)、界面結(jié)構(gòu)、介電環(huán)境、與受體的結(jié)合狀態(tài)等有關(guān)[12,13]。本文采用分光光度法和熒光法研究太陽光照制備得到的兩種不同顏色的納米銀溶膠與熒光素的相互作用。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

UV2600型分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；F-4500熒光分光光度計（日本日立公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；FL（AR，沈陽市試劑三廠）；硝酸銀（AR，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠）；檸檬酸三鈉（TSC）（AR，天津市化學試劑一廠）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（K30）（AR，國藥集團化學試劑有限公司，進口分裝）；實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 納米銀溶膠的制備

取 5.00 mL 2.11×10-3mol·L-1硝酸銀水溶液置于 250 mL碘量瓶中，加入0.010 0 g PVP，搖勻，待其溶解后加入94 mL水，超聲30 min后加入約1 mL 1%(wt) TSC水溶液，使反應溶液總體積為100 mL，繼續(xù)超聲30 min，得無色透明溶液。置于太陽光下照射，記錄光照時間及其顏色變化，測定不同光照時間對應的 UV-Vis吸收光譜。將制得的納米銀溶膠，置于4 ℃冰箱中保存，測定放置不同時間后的UV-Vis光譜，研究其穩(wěn)定性。

1.3 紫外法研究納米銀溶膠與熒光素的作用

在一系列10 mL比色管中，分別加入2.00 mL 2.50×10-5mol·L-1FL乙醇溶液，然后依次加入不同體積的按1.2制備得到的紅色或藍色納米銀溶膠（納米銀的濃度按銀原子計算為 1.06×10-4mol·L-1），加水稀釋至 5.00 mL，搖勻，避光放置30 min后，測定其吸收光譜。

1.4 熒光法研究納米銀溶膠與熒光素的相互作用

在一系列10 mL比色管中，分別加入2.00 mL 2.50×10-5mol·L-1FL乙醇溶液，然后分別加入不同體積的1.06×10-4mol·L-1紅色或藍色納米銀溶膠，加水稀釋到5.00 mL，搖勻，避光放置30 min后，固定激發(fā)波長λex=491 nm，測定其熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米銀溶膠的制備、表征及穩(wěn)定性

2.1.1 藍色納米銀溶膠

按照1.2實驗方法，在太陽光照較弱時制得了藍色納米銀溶膠。光照過程中，反應液經(jīng)歷的顏色變化如表1所示，對應的UV-Vis吸收光譜如圖1所示。

表1 藍色納米銀溶膠制備過程中的顏色變化和對應的UV-Vis吸收光譜變化（光強較弱）

由表1可知，在光照3 h時間內(nèi)，隨著光照時間的延長，反應液的顏色依次由無色→粉紅色→紫色→藍色。貴金屬納米粒子對光的吸收是由價帶電子與電磁場的相互作用產(chǎn)生的連續(xù)振動，即表面等離子體共振（SPR）而產(chǎn)生的，這是小粒子尺寸效應的表現(xiàn)，在塊體材料中不存在。金屬納米粒子的SPR峰的位置和形狀與粒子的大小、介電常數(shù)及其表面吸附情況有很大關(guān)系，銀納米粒子的SPR吸收和光散射導致其在可見光譜范圍內(nèi)呈現(xiàn)鮮亮的顏色[14]。球形納米銀粒子的SPR峰一般在400 nm附近，三角形納米銀對應的SPR峰在530-600 nm附近。從吸收峰的位置、半高寬和峰強度三個方面可以初步判斷納米銀的形成情況：吸收峰的位置基本上可以定性判斷納米粒子的大小，在通常情況下，粒子越小，吸收峰的位置就越藍移；在金屬膠體中，通常吸收峰的半高寬越寬，粒子尺寸分布就越寬；若金屬膠體在不同時刻其吸收峰位置、半高寬均不改變，而吸收峰的強度增大，說明金屬粒子濃度增大，即單位體積內(nèi)粒子數(shù)增多[15]。因此在納米銀溶膠制備過程中，不但可以從反應溶液的顏色判斷納米銀溶膠的產(chǎn)生，而且可以通過 UV-Vis吸收光譜來證明納米銀溶膠的形成。

圖1 藍色銀溶膠制備過程中的UV-Vis光譜

由圖1中可見，在3 h內(nèi)，隨著光照時間的延長，出現(xiàn)兩個SPR峰，且對應的峰強度逐漸增大。410 nm處的吸收峰的峰位無明顯變化；而600 nm左右的吸收峰的峰位發(fā)生了明顯的紅移。由 UV-Vis光譜的變化，可以初步推測所制備的藍色納米銀溶膠中至少存在球形和三角形兩種形貌的納米銀粒子，并且反應過程中納米銀粒子的數(shù)量逐漸增多。

將反應175 min制備得到的藍色納米銀溶膠置于4 ℃冰箱中保存，通過檢測其 UV-Vis光譜可知，藍色納米銀溶膠在4 ℃避光保存的條件下可以至少穩(wěn)定兩個月。

2.1.2 紅色納米銀溶膠

按照1.2實驗方法，在光照強度較強時制得了紅色納米銀溶膠。表2給出了在光照過程中反應液經(jīng)歷的顏色變化及對應的UV-Vis光譜數(shù)據(jù)。

表2 紅色納米銀溶膠制備過程中的顏色變化和對應的UV-Vis吸收光譜變化（光強較強）

從表2可知，在32 min內(nèi)，隨著光照時間的延長，反應液的顏色依次由無色→黃色→橙黃色→橙紅色→酒紅色。實驗發(fā)現(xiàn)，當溶液顏色變?yōu)榫萍t色且吸光度為0.3左右時，如果繼續(xù)光照，溶液就會變成濁色，不再清澈透明，所以當吸光度為0.3左右時停止光照。圖2是對應的UV-Vis吸收光譜。

圖2 紅色納米銀溶膠制備過程中的UV-Vis光譜

由圖2可知，在32 min內(nèi)，隨著光照時間的延長，430-500 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個明顯的吸收峰，吸收峰位置發(fā)生紅移，其對應的峰強度逐漸增大，表明得到納米銀的數(shù)量在增加。

當溶液的顏色變成紅色，且吸光度較大時，于4 ℃冰箱中保存。通過檢測納米銀溶膠的 UV-Vis光譜可知，納米銀溶膠在4 ℃避光保存至少可以穩(wěn)定15天。

通過比較可知，上述兩種不同光照強度時制得納米銀的顏色和光譜有很大差異，說明光照強度對納米銀的形貌有明顯影響。

2.2 光度法研究納米銀溶膠與FL的相互作用

2.2.1 藍色納米銀溶膠與FL的相互作用

2.2.1.1 UV-Vis分光光度法

圖3 FL與藍色納米銀溶膠混合后的UV-Vis光譜

圖4 藍色納米銀（32 μmol·L-1）、FL（1.00×10-5 mol·L-1）及二者混合溶液的UV-Vis光譜

圖3 為FL與不同濃度的藍色納米銀溶膠混合溶液的UV-Vis吸收光譜。加入藍色納米銀溶膠后，F(xiàn)L的特征吸收峰（474 nm）發(fā)生紅移，當藍色納米銀溶膠的濃度為32 μmol·L-1時，峰位紅移13 nm。此后，隨著銀溶膠濃度的繼續(xù)增加，峰位保持不變，但峰強度依然增大。圖4為藍色銀溶膠、FL、FL-藍色銀溶膠混合液的吸收光譜，以及納米銀膠和 FL的加和光譜。混合溶液的吸收光譜與其加和光譜有較大的差別，表明 FL與藍色納米銀溶膠混合溶液的吸收光譜不是二者的簡單加和，混合體系中出現(xiàn)了不同于FL分子和納米銀溶膠的新復合物。FL分子在水溶液中以陰離子形式存在，其-COO-與藍色納米納米銀溶膠之間存在較強的相互作用，在納米銀表面形成了 FLn-Ag復合物。同時，藍色納米銀表面等離子體在外場的激發(fā)下產(chǎn)生的強局域場也會對其表面及附近的 FL分子產(chǎn)生作用。表面局域場的物理作用及表面分子間的化學作用是 FL的吸收峰產(chǎn)生紅移的主要原因[2]。

2.2.1.2 熒光法研究

圖5為FL與藍色銀溶膠混合溶液的熒光發(fā)射光譜。

由圖5可知，加入藍色納米銀溶膠后，F(xiàn)L的熒光強度隨著銀溶膠加入量的增加而逐漸增強；當銀溶膠濃度增加至32 μmol·L-1時，熒光強度達到最大；此后熒光強度隨銀溶膠濃度的增加不再變化。此外，從圖5可以看出，與FL本身的熒光發(fā)射光譜相比，混合體系的熒光發(fā)射光譜沒有本質(zhì)的改變，說明FLn-Ag復合物的形成并沒有破壞FL分子內(nèi)的熒光團。

圖5 FL與藍色銀溶膠混合溶液的熒光發(fā)射光譜

據(jù)文獻報道[2]，具有金屬性的納米結(jié)構(gòu)（如金屬納米微粒、納米線等）可通過表面等離子激元與光子間強烈的共振耦合，極大地增強納米結(jié)構(gòu)周圍的電磁場，進而提高納米結(jié)構(gòu)附近發(fā)光體的激發(fā)強度，將能量傳至系統(tǒng)的發(fā)光中心，使發(fā)光中心的輻射躍遷幾率大幅度提高，熒光增強。在本文的實驗條件下，納米銀膠的引入使 FL熒光增強，分析認為主要與下列三個因素有關(guān)：

（1）FL包覆在納米銀粒子表面，使 FL中的熒光團與納米銀表面的距離縮短至有效能量傳輸距離；

（2）FL分子在水溶液中以陰離子形式存在，其羧基（-COO-）與納米銀之間存在較強的相互作用，納米銀表面形成了FLn-Ag復合物，從而使光吸收增強；

（3）納米銀粒子通過FL相互橋連使其產(chǎn)生的局域場相互疊加，局域場增強。

在上述因素的共同作用下納米銀粒子將所收集的激發(fā)光能量通過強局域場傳輸給FL分子，使其熒光增強[2]。當納米銀溶膠的濃度達到32 μmol·L-1時，大量納米銀粒子的存在使納米粒子表面等離子激元共振受到抑制，局域場強下降。另外，大量的 FL分子吸附在納米銀粒子表面，使FL分子與納米銀粒子間有效傳輸距離減小，使得熒光強度增加的幅度降低，直至接近不變。

2.2.2 紅色納米銀溶膠與FL的相互作用

2.2.2.1 UV-Vis分光光度法

圖6為FL與紅色納米銀溶膠混合溶液的UV-Vis吸收光譜。

加入紅色納米銀溶膠后，F(xiàn)L特征吸收峰（474 nm）發(fā)生紅移，當銀溶膠的濃度為32 μmol·L-1時，峰位紅移13 nm。此后，隨著銀溶膠濃度的繼續(xù)增加，峰位保持不變，但強度依然增大。然而當加入1 μmol·L-1紅色銀溶膠后，其吸收峰強度低于FL本身的，且峰位稍有藍移。

圖6 FL與紅色納米銀溶膠混合溶液的UV-Vis光譜

圖7 紅色納米銀（32 μmol·L-1）、FL（1.00×10-5 mol·L-1）及二者混合溶液的UV-Vis吸收光譜

圖7為藍色銀溶膠、FL、FL-紅色銀溶膠混合液的吸收光譜，以及納米銀膠和 FL的加和光譜。混合溶液的吸收光譜與其加和光譜有較大的差別，與藍色納米銀相似，表明在紅色納米銀表面形成了FLn-Ag復合物。

2.2.2.2 熒光法研究相互作用

圖8為FL和紅色納米銀溶膠混合后體系的熒光發(fā)射光譜。

圖8 FL與紅色銀溶膠混合溶液的熒光發(fā)射光譜

從圖8中可以看到，當FL中加入紅色納米銀溶膠，F(xiàn)L的熒光強度隨著紅色納米銀溶膠加入量的增加而增大，當銀溶膠濃度為21 μmol·L-1時，熒光強度達到最大。此后熒光強度隨著銀溶膠濃度的增大保持不變。與藍色銀膠的情況相似，加入紅色納米銀膠后，與 FL比較，體系的熒光發(fā)射光譜形貌無明顯改變，說明 FLn-Ag復合物的形成并沒有破壞 FL分子內(nèi)的熒光團。然而當紅色納米銀溶膠的濃度為1 μmol·L-1時，混合液的熒光強度低于FL自身溶液的，且峰位稍有藍移。另外，紅色納米銀溶膠與熒光素作用后熒光強度的增加量小于藍色納米銀溶膠的。紅色和藍色納米銀與 FL作用情況有所差異，推測是由于兩種納米銀的形貌不同所致。

3 結(jié)論

利用檸檬酸三鈉光化學還原硝酸銀，通過控制太陽光照強度和光照時間制備了穩(wěn)定的藍色和紅色納米銀溶膠。FL分子包覆在納米銀溶膠表面形成FLn-Ag復合物，使納米銀溶膠相互橋連形成類似網(wǎng)絡的結(jié)構(gòu)，納米銀通過產(chǎn)生的強局域場將能量傳輸給FL發(fā)光中心，實現(xiàn)了FL的熒光增強。

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