納米銀溶膠的制備及其與熒光素相互作用的研究

劉征原，廉志紅，張鐵莉，于 翠

（1.河北聯(lián)合大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，河北 唐山 063009；2.唐山師范學(xué)院 化學(xué)系，河北 唐山 063000）

納米粒子是指直徑在1-100 nm之間的粒子，也稱(chēng)為超微粒子。納米粒子具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)，因而顯示出不同于常規(guī)材料的熱、光、電、磁、催化等效應(yīng)[1]。金屬納米粒子的表面等離子體共振可以極大地增強(qiáng)粒子周?chē)碾姶艌?chǎng)，這種局域場(chǎng)可以改變吸附于其表面周?chē)臒晒怏w的自由空間條件，使其熒光增強(qiáng)或猝滅[2]。金屬納米材料以貴金屬金、銀、銅為代表，其中納米銀粒子在表面增強(qiáng)拉曼光譜、表面增強(qiáng)共振散射光譜、分子生物學(xué)、超分子體系等研究領(lǐng)域占有極為重要的地位[3]。納米銀溶膠的制備方法有多種，最常用的方法是化學(xué)還原法[4,5]。本文首次以太陽(yáng)為光源，以聚乙烯吡咯烷酮為保護(hù)劑，用檸檬酸三鈉還原硝酸銀，制備了兩種顏色的納米銀溶膠，這種制備方法克服了其他光化學(xué)還原法需要特定的光源及特制反應(yīng)器的限制[6-8]。

熒光素（fluorescein，F(xiàn)L）[9]因具有較高的熒光量子產(chǎn)率而被廣泛應(yīng)用于 DNA雜化、生物分子的檢測(cè)等方面。高濃度時(shí) FL易發(fā)生熒光自猝滅，因此作為熒光標(biāo)記物使用時(shí)，須控制在較低濃度范圍內(nèi)，但因熒光強(qiáng)度弱而給檢測(cè)帶來(lái)困難。在 FL體系中引入金屬納米結(jié)構(gòu)，可以利用納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的強(qiáng)局域場(chǎng)使其熒光增強(qiáng)[10,11]。Malicka等[10]以 FL為熒光探針在銀島膜上進(jìn)行熒光素標(biāo)記 DNA的研究，發(fā)現(xiàn)FL熒光強(qiáng)度提高了7倍。金屬納米結(jié)構(gòu)的能量傳輸性質(zhì)決定于光輻射與納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的局域電磁場(chǎng)狀態(tài)，而后者與納米材料的顯微結(jié)構(gòu)、幾何狀態(tài)、界面結(jié)構(gòu)、介電環(huán)境、與受體的結(jié)合狀態(tài)等有關(guān)[12,13]。本文采用分光光度法和熒光法研究太陽(yáng)光照制備得到的兩種不同顏色的納米銀溶膠與熒光素的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

UV2600型分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；F-4500熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；FL（AR，沈陽(yáng)市試劑三廠）；硝酸銀（AR，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；檸檬酸三鈉（TSC）（AR，天津市化學(xué)試劑一廠）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（K30）（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，進(jìn)口分裝）；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 納米銀溶膠的制備

取 5.00 mL 2.11×10-3mol·L-1硝酸銀水溶液置于 250 mL碘量瓶中，加入0.010 0 g PVP，搖勻，待其溶解后加入94 mL水，超聲30 min后加入約1 mL 1%(wt) TSC水溶液，使反應(yīng)溶液總體積為100 mL，繼續(xù)超聲30 min，得無(wú)色透明溶液。置于太陽(yáng)光下照射，記錄光照時(shí)間及其顏色變化，測(cè)定不同光照時(shí)間對(duì)應(yīng)的 UV-Vis吸收光譜。將制得的納米銀溶膠，置于4 ℃冰箱中保存，測(cè)定放置不同時(shí)間后的UV-Vis光譜，研究其穩(wěn)定性。

1.3 紫外法研究納米銀溶膠與熒光素的作用

在一系列10 mL比色管中，分別加入2.00 mL 2.50×10-5mol·L-1FL乙醇溶液，然后依次加入不同體積的按1.2制備得到的紅色或藍(lán)色納米銀溶膠（納米銀的濃度按銀原子計(jì)算為 1.06×10-4mol·L-1），加水稀釋至 5.00 mL，搖勻，避光放置30 min后，測(cè)定其吸收光譜。

1.4 熒光法研究納米銀溶膠與熒光素的相互作用

在一系列10 mL比色管中，分別加入2.00 mL 2.50×10-5mol·L-1FL乙醇溶液，然后分別加入不同體積的1.06×10-4mol·L-1紅色或藍(lán)色納米銀溶膠，加水稀釋到5.00 mL，搖勻，避光放置30 min后，固定激發(fā)波長(zhǎng)λex=491 nm，測(cè)定其熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米銀溶膠的制備、表征及穩(wěn)定性

2.1.1 藍(lán)色納米銀溶膠

按照1.2實(shí)驗(yàn)方法，在太陽(yáng)光照較弱時(shí)制得了藍(lán)色納米銀溶膠。光照過(guò)程中，反應(yīng)液經(jīng)歷的顏色變化如表1所示，對(duì)應(yīng)的UV-Vis吸收光譜如圖1所示。

表1 藍(lán)色納米銀溶膠制備過(guò)程中的顏色變化和對(duì)應(yīng)的UV-Vis吸收光譜變化（光強(qiáng)較弱）

由表1可知，在光照3 h時(shí)間內(nèi)，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)液的顏色依次由無(wú)色→粉紅色→紫色→藍(lán)色。貴金屬納米粒子對(duì)光的吸收是由價(jià)帶電子與電磁場(chǎng)的相互作用產(chǎn)生的連續(xù)振動(dòng)，即表面等離子體共振（SPR）而產(chǎn)生的，這是小粒子尺寸效應(yīng)的表現(xiàn)，在塊體材料中不存在。金屬納米粒子的SPR峰的位置和形狀與粒子的大小、介電常數(shù)及其表面吸附情況有很大關(guān)系，銀納米粒子的SPR吸收和光散射導(dǎo)致其在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)呈現(xiàn)鮮亮的顏色[14]。球形納米銀粒子的SPR峰一般在400 nm附近，三角形納米銀對(duì)應(yīng)的SPR峰在530-600 nm附近。從吸收峰的位置、半高寬和峰強(qiáng)度三個(gè)方面可以初步判斷納米銀的形成情況：吸收峰的位置基本上可以定性判斷納米粒子的大小，在通常情況下，粒子越小，吸收峰的位置就越藍(lán)移；在金屬膠體中，通常吸收峰的半高寬越寬，粒子尺寸分布就越寬；若金屬膠體在不同時(shí)刻其吸收峰位置、半高寬均不改變，而吸收峰的強(qiáng)度增大，說(shuō)明金屬粒子濃度增大，即單位體積內(nèi)粒子數(shù)增多[15]。因此在納米銀溶膠制備過(guò)程中，不但可以從反應(yīng)溶液的顏色判斷納米銀溶膠的產(chǎn)生，而且可以通過(guò) UV-Vis吸收光譜來(lái)證明納米銀溶膠的形成。

圖1 藍(lán)色銀溶膠制備過(guò)程中的UV-Vis光譜

由圖1中可見(jiàn)，在3 h內(nèi)，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)兩個(gè)SPR峰，且對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度逐漸增大。410 nm處的吸收峰的峰位無(wú)明顯變化；而600 nm左右的吸收峰的峰位發(fā)生了明顯的紅移。由 UV-Vis光譜的變化，可以初步推測(cè)所制備的藍(lán)色納米銀溶膠中至少存在球形和三角形兩種形貌的納米銀粒子，并且反應(yīng)過(guò)程中納米銀粒子的數(shù)量逐漸增多。

將反應(yīng)175 min制備得到的藍(lán)色納米銀溶膠置于4 ℃冰箱中保存，通過(guò)檢測(cè)其 UV-Vis光譜可知，藍(lán)色納米銀溶膠在4 ℃避光保存的條件下可以至少穩(wěn)定兩個(gè)月。

2.1.2 紅色納米銀溶膠

按照1.2實(shí)驗(yàn)方法，在光照強(qiáng)度較強(qiáng)時(shí)制得了紅色納米銀溶膠。表2給出了在光照過(guò)程中反應(yīng)液經(jīng)歷的顏色變化及對(duì)應(yīng)的UV-Vis光譜數(shù)據(jù)。

表2 紅色納米銀溶膠制備過(guò)程中的顏色變化和對(duì)應(yīng)的UV-Vis吸收光譜變化（光強(qiáng)較強(qiáng)）

從表2可知，在32 min內(nèi)，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)液的顏色依次由無(wú)色→黃色→橙黃色→橙紅色→酒紅色。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液顏色變?yōu)榫萍t色且吸光度為0.3左右時(shí)，如果繼續(xù)光照，溶液就會(huì)變成濁色，不再清澈透明，所以當(dāng)吸光度為0.3左右時(shí)停止光照。圖2是對(duì)應(yīng)的UV-Vis吸收光譜。

圖2 紅色納米銀溶膠制備過(guò)程中的UV-Vis光譜

由圖2可知，在32 min內(nèi)，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，430-500 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)明顯的吸收峰，吸收峰位置發(fā)生紅移，其對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度逐漸增大，表明得到納米銀的數(shù)量在增加。

當(dāng)溶液的顏色變成紅色，且吸光度較大時(shí)，于4 ℃冰箱中保存。通過(guò)檢測(cè)納米銀溶膠的 UV-Vis光譜可知，納米銀溶膠在4 ℃避光保存至少可以穩(wěn)定15天。

通過(guò)比較可知，上述兩種不同光照強(qiáng)度時(shí)制得納米銀的顏色和光譜有很大差異，說(shuō)明光照強(qiáng)度對(duì)納米銀的形貌有明顯影響。

2.2 光度法研究納米銀溶膠與FL的相互作用

2.2.1 藍(lán)色納米銀溶膠與FL的相互作用

2.2.1.1 UV-Vis分光光度法

圖3 FL與藍(lán)色納米銀溶膠混合后的UV-Vis光譜

圖4 藍(lán)色納米銀（32 μmol·L-1）、FL（1.00×10-5 mol·L-1）及二者混合溶液的UV-Vis光譜

圖3 為FL與不同濃度的藍(lán)色納米銀溶膠混合溶液的UV-Vis吸收光譜。加入藍(lán)色納米銀溶膠后，F(xiàn)L的特征吸收峰（474 nm）發(fā)生紅移，當(dāng)藍(lán)色納米銀溶膠的濃度為32 μmol·L-1時(shí)，峰位紅移13 nm。此后，隨著銀溶膠濃度的繼續(xù)增加，峰位保持不變，但峰強(qiáng)度依然增大。圖4為藍(lán)色銀溶膠、FL、FL-藍(lán)色銀溶膠混合液的吸收光譜，以及納米銀膠和 FL的加和光譜?；旌先芤旱奈展庾V與其加和光譜有較大的差別，表明 FL與藍(lán)色納米銀溶膠混合溶液的吸收光譜不是二者的簡(jiǎn)單加和，混合體系中出現(xiàn)了不同于FL分子和納米銀溶膠的新復(fù)合物。FL分子在水溶液中以陰離子形式存在，其-COO-與藍(lán)色納米納米銀溶膠之間存在較強(qiáng)的相互作用，在納米銀表面形成了 FLn-Ag復(fù)合物。同時(shí)，藍(lán)色納米銀表面等離子體在外場(chǎng)的激發(fā)下產(chǎn)生的強(qiáng)局域場(chǎng)也會(huì)對(duì)其表面及附近的 FL分子產(chǎn)生作用。表面局域場(chǎng)的物理作用及表面分子間的化學(xué)作用是 FL的吸收峰產(chǎn)生紅移的主要原因[2]。

2.2.1.2 熒光法研究

圖5為FL與藍(lán)色銀溶膠混合溶液的熒光發(fā)射光譜。

由圖5可知，加入藍(lán)色納米銀溶膠后，F(xiàn)L的熒光強(qiáng)度隨著銀溶膠加入量的增加而逐漸增強(qiáng)；當(dāng)銀溶膠濃度增加至32 μmol·L-1時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；此后熒光強(qiáng)度隨銀溶膠濃度的增加不再變化。此外，從圖5可以看出，與FL本身的熒光發(fā)射光譜相比，混合體系的熒光發(fā)射光譜沒(méi)有本質(zhì)的改變，說(shuō)明FLn-Ag復(fù)合物的形成并沒(méi)有破壞FL分子內(nèi)的熒光團(tuán)。

圖5 FL與藍(lán)色銀溶膠混合溶液的熒光發(fā)射光譜

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，具有金屬性的納米結(jié)構(gòu)（如金屬納米微粒、納米線等）可通過(guò)表面等離子激元與光子間強(qiáng)烈的共振耦合，極大地增強(qiáng)納米結(jié)構(gòu)周?chē)碾姶艌?chǎng)，進(jìn)而提高納米結(jié)構(gòu)附近發(fā)光體的激發(fā)強(qiáng)度，將能量傳至系統(tǒng)的發(fā)光中心，使發(fā)光中心的輻射躍遷幾率大幅度提高，熒光增強(qiáng)。在本文的實(shí)驗(yàn)條件下，納米銀膠的引入使 FL熒光增強(qiáng)，分析認(rèn)為主要與下列三個(gè)因素有關(guān)：

（1）FL包覆在納米銀粒子表面，使 FL中的熒光團(tuán)與納米銀表面的距離縮短至有效能量傳輸距離；

（2）FL分子在水溶液中以陰離子形式存在，其羧基（-COO-）與納米銀之間存在較強(qiáng)的相互作用，納米銀表面形成了FLn-Ag復(fù)合物，從而使光吸收增強(qiáng)；

（3）納米銀粒子通過(guò)FL相互橋連使其產(chǎn)生的局域場(chǎng)相互疊加，局域場(chǎng)增強(qiáng)。

在上述因素的共同作用下納米銀粒子將所收集的激發(fā)光能量通過(guò)強(qiáng)局域場(chǎng)傳輸給FL分子，使其熒光增強(qiáng)[2]。當(dāng)納米銀溶膠的濃度達(dá)到32 μmol·L-1時(shí)，大量納米銀粒子的存在使納米粒子表面等離子激元共振受到抑制，局域場(chǎng)強(qiáng)下降。另外，大量的 FL分子吸附在納米銀粒子表面，使FL分子與納米銀粒子間有效傳輸距離減小，使得熒光強(qiáng)度增加的幅度降低，直至接近不變。

2.2.2 紅色納米銀溶膠與FL的相互作用

2.2.2.1 UV-Vis分光光度法

圖6為FL與紅色納米銀溶膠混合溶液的UV-Vis吸收光譜。

加入紅色納米銀溶膠后，F(xiàn)L特征吸收峰（474 nm）發(fā)生紅移，當(dāng)銀溶膠的濃度為32 μmol·L-1時(shí)，峰位紅移13 nm。此后，隨著銀溶膠濃度的繼續(xù)增加，峰位保持不變，但強(qiáng)度依然增大。然而當(dāng)加入1 μmol·L-1紅色銀溶膠后，其吸收峰強(qiáng)度低于FL本身的，且峰位稍有藍(lán)移。

圖6 FL與紅色納米銀溶膠混合溶液的UV-Vis光譜

圖7 紅色納米銀（32 μmol·L-1）、FL（1.00×10-5 mol·L-1）及二者混合溶液的UV-Vis吸收光譜

圖7為藍(lán)色銀溶膠、FL、FL-紅色銀溶膠混合液的吸收光譜，以及納米銀膠和 FL的加和光譜。混合溶液的吸收光譜與其加和光譜有較大的差別，與藍(lán)色納米銀相似，表明在紅色納米銀表面形成了FLn-Ag復(fù)合物。

2.2.2.2 熒光法研究相互作用

圖8為FL和紅色納米銀溶膠混合后體系的熒光發(fā)射光譜。

圖8 FL與紅色銀溶膠混合溶液的熒光發(fā)射光譜

從圖8中可以看到，當(dāng)FL中加入紅色納米銀溶膠，F(xiàn)L的熒光強(qiáng)度隨著紅色納米銀溶膠加入量的增加而增大，當(dāng)銀溶膠濃度為21 μmol·L-1時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。此后熒光強(qiáng)度隨著銀溶膠濃度的增大保持不變。與藍(lán)色銀膠的情況相似，加入紅色納米銀膠后，與 FL比較，體系的熒光發(fā)射光譜形貌無(wú)明顯改變，說(shuō)明 FLn-Ag復(fù)合物的形成并沒(méi)有破壞 FL分子內(nèi)的熒光團(tuán)。然而當(dāng)紅色納米銀溶膠的濃度為1 μmol·L-1時(shí)，混合液的熒光強(qiáng)度低于FL自身溶液的，且峰位稍有藍(lán)移。另外，紅色納米銀溶膠與熒光素作用后熒光強(qiáng)度的增加量小于藍(lán)色納米銀溶膠的。紅色和藍(lán)色納米銀與 FL作用情況有所差異，推測(cè)是由于兩種納米銀的形貌不同所致。

3 結(jié)論

利用檸檬酸三鈉光化學(xué)還原硝酸銀，通過(guò)控制太陽(yáng)光照強(qiáng)度和光照時(shí)間制備了穩(wěn)定的藍(lán)色和紅色納米銀溶膠。FL分子包覆在納米銀溶膠表面形成FLn-Ag復(fù)合物，使納米銀溶膠相互橋連形成類(lèi)似網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，納米銀通過(guò)產(chǎn)生的強(qiáng)局域場(chǎng)將能量傳輸給FL發(fā)光中心，實(shí)現(xiàn)了FL的熒光增強(qiáng)。

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