愈骨膠囊促進(jìn)兔骨折愈合的分子機(jī)制初探

王 琴，易美彤，曾 敏

(1.重慶市中醫(yī)院;2.重慶市中醫(yī)院病理科;3.重慶市中醫(yī)特色治療工程技術(shù)研究中心，重慶 400021)

愈骨膠囊由血竭、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、自然銅、元胡等組成，前期藥效學(xué)研究結(jié)果表明，愈骨膠囊具有消炎止痛，促進(jìn)鈣鹽沉積和骨折愈合的作用［1-2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物力學(xué)和病理組織學(xué)考察愈骨膠囊對(duì)骨折愈合和成骨細(xì)胞、膠原纖維以及軟骨形成等的影響，通過(guò)免疫組化觀察愈骨膠囊對(duì)骨痂組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響，探討愈骨膠囊促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 愈骨膠囊由重慶市中醫(yī)院藥物研究部提供(批號(hào)091215);接骨七厘片(湖南金沙制藥股份有限公司，批號(hào)100610);依據(jù)臨床使用劑量換算出給藥劑量，純化水配制。

1.2 主要儀器和試劑 Instron1011型萬(wàn)能材料機(jī)(美國(guó)Instron);OLYMPUS CX31顯微鏡(日本 O-lympus)，Elix3超純水系統(tǒng)(美國(guó) Millipore);HWS24型電熱恒溫水浴箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);硫酸慶大霉素注射液(太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)100701);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號(hào):S1005314);戊巴比妥鈉(上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào):090205)。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) (1)健康雄性新西蘭大耳白兔100只，體質(zhì)量為(2.5±0.5)kg［購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(渝)2007-0001］。(2)分組及處理:動(dòng)物分成4組:正常組(10只)、模型組(30只)、愈骨膠囊組(30只)和接骨七厘片組(30只)。除正常組外，實(shí)驗(yàn)兔按30 mg/kg經(jīng)腹腔注射給予3%戊巴比妥鈉，在麻醉狀態(tài)下，采用柴本甫法制備骨折模型［3］。灌胃給藥，愈骨膠囊組劑量為0.138 g/kg，接骨七厘片組劑量為0.115 g/kg，模型組給予等體積純化水。連續(xù)給藥2、4、6周后，進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)定，骨痂組織病理學(xué)觀察和免疫組化觀察。圖像用Image-Pro plus 6.0軟件，對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度值(MOD)進(jìn)行半定量分析［4］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以表示，各組間的比較采用單因素方差分析ANOVA基礎(chǔ)上的LSD-t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 愈骨膠囊對(duì)骨折橈骨的生物力學(xué)影響 三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1～3。結(jié)果表明:在各時(shí)相點(diǎn)，與正常組相比，模型組的最大載荷，最大位移和彈性模數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);在第2周，愈骨膠囊組的最大位移和彈性模數(shù)與模型組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);在第4、第6周，愈骨膠囊組的最大載荷，最大位移和彈性模數(shù)與模型組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。與接骨七厘片組相比，在各時(shí)相點(diǎn)，愈骨膠囊組的最大載荷，最大位移和彈性模數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 愈骨膠囊對(duì)兔橈骨骨折后最大載荷的影響(N)(，n=5)Tab.1 Effect of Yugu Capsules on maximum load of rabbits with radius fracture(N)(，n=5)

表1 愈骨膠囊對(duì)兔橈骨骨折后最大載荷的影響(N)(，n=5)Tab.1 Effect of Yugu Capsules on maximum load of rabbits with radius fracture(N)(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 2周 4周 6周156.03±18.19 156.03±18.19 156.03±18.19模型組 44.28±7.53* 47.40±6.78* 52.84±12.02*接骨七厘片組 51.16±6.33* 76.90±11.50*# 103.32±14.28#愈骨膠囊組 50.98±6.71* 79.09±11.34*# 112.25±18.61正常組#

表2 愈骨膠囊對(duì)兔橈骨骨折后最大位移的影響(mm)(，n=5)Tab.2 Effect of Yugu Capsules on maximum displacement of rabbits with radius fracture(mm)(，n=5)

表2 愈骨膠囊對(duì)兔橈骨骨折后最大位移的影響(mm)(，n=5)Tab.2 Effect of Yugu Capsules on maximum displacement of rabbits with radius fracture(mm)(，n=5)

分 組 2周 4周 6周3.17±0.48 3.17±0.48 3.17±0.48模型組 1.03±0.22* 1.19±0.29* 1.32±0.28*接骨七厘片組 1.84±0.40*#2.19±0.36*# 2.62±0.32#愈骨膠囊組 1.80±0.38*#2.23±0.42*# 2.71±0.35正常組#

表3 愈骨膠囊對(duì)兔橈骨骨折后彈性模數(shù)的影響(MPa)(，n=5)Tab.3 Effect of Yugu Capsules on elastic modulus of rabbits with radius fracture(MPa)(，n=5)

表3 愈骨膠囊對(duì)兔橈骨骨折后彈性模數(shù)的影響(MPa)(，n=5)Tab.3 Effect of Yugu Capsules on elastic modulus of rabbits with radius fracture(MPa)(，n=5)

分 組 2周 4周 6周正常組 2781.21±413.28 2781.21±413.28 2781.21±413.28模型組 756.64±137.68* 867.78±108.12* 1003.72±168.14*接骨七厘片組 1337.68±341.67*#1639.60±328.30*# 2197.10±411.58*#愈骨膠囊組 1427.73±329.34*#1808.13±402.76*# 2217.07±443.64*#

2.2 愈骨膠囊對(duì)骨痂病理組織的影響 骨痂病理組織的HE染色結(jié)果表明:正常組的骨組織排列整齊，染色均勻;在實(shí)驗(yàn)第2周，模型組骨折間隙成纖維細(xì)胞增生明顯，接骨七厘片組骨折間隙內(nèi)軟骨島和編織骨形成，愈骨膠囊組骨折間隙可見(jiàn)纖維性骨痂和軟骨島形成;在實(shí)驗(yàn)第4周，模型組可見(jiàn)軟骨島與較多新骨形成，部分形成編織骨，接骨七厘片組骨折間隙被新骨充填，編織骨完全形成，愈骨膠囊組編織骨完全形成，且可見(jiàn)板層骨出現(xiàn);在實(shí)驗(yàn)第6周，愈骨膠囊組骨斷端由重塑的板層骨連接，髓腔貫通;接骨七厘片組髓腔貫通，板層骨欠成熟，而模型組部分板層骨形成。

Masson染色結(jié)果表明:與正常組相比，模型組在各觀察時(shí)相點(diǎn)的光密度(MOD)值增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);與模型組相比，愈骨膠囊組在實(shí)驗(yàn)第2、4周時(shí)，MOD值增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見(jiàn)表4，圖1。甲苯胺蘭染色結(jié)果表明:與正常組相比，在各觀察時(shí)相點(diǎn)，模型組MOD值增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);與模型組相比，愈骨膠囊組第4周時(shí)的MOD值增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見(jiàn)表5，圖2。

表4 愈骨膠囊對(duì)骨痂組織膠原纖維光密度的影響(，n=5)Tab.4 Effect of Yugu Capsules on collagen fiber in callus(，n=5)

表4 愈骨膠囊對(duì)骨痂組織膠原纖維光密度的影響(，n=5)Tab.4 Effect of Yugu Capsules on collagen fiber in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 第2周 第4周 第6周0.0043±0.0007 0.0043±0.0007 0.0043±0.0007模型組 0.0157±0.0009* 0.1161±0.0102* 0.3031±0.0251*接骨七厘片組 0.0413±0.0045# 0.1452±0.0078 0.3326±0.0255愈骨膠囊組 0.0430±0.0060# 0.4679±0.0340#正常組0.2434±0.0380

圖1 骨痂組織染色照片(Masson，10×10)Fig.1 Pathological tissue section photographs of callus(Masson，10×10)

表5 愈骨膠囊對(duì)骨痂組織軟骨光密度的影響(，n=5)Tab.5 Effect of Yugu Capsules on cartilage in callus(，n=5)

表5 愈骨膠囊對(duì)骨痂組織軟骨光密度的影響(，n=5)Tab.5 Effect of Yugu Capsules on cartilage in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 2周 4周 6周正常組0.0053±0.0010 0.0053±0.0010 0.0053±0.0010模型組 0.1342±0.0050* 0.2200±0.0292* 0.1884±0.0083*接骨七厘片組 0.2340±0.0276# 0.3042±0.0240 0.0165±0.0030#愈骨膠囊組 0.2266±0.0272 0.3457±0.0393#0.1264±0.0173

圖2 骨痂組織染色照片(甲苯胺蘭，10×10)Fig.2 Pathological tissue section photographs of callus(methylaniline blue，10×10)

2.3 愈骨膠囊對(duì)骨痂中TGF-β和VEGF的影響免疫組化結(jié)果表明，與正常組相比，模型組中TGF-β和VEGF表達(dá)均在第2周時(shí)增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，隨后減弱;與模型組相比，愈骨膠囊組中TGF-β和VEGF表達(dá)均呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，在第4周時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見(jiàn)表6，圖3，表7，圖4。

3 討論

采用HE、Masson、甲苯胺藍(lán)3種染色方法相結(jié)合，能從形態(tài)學(xué)上直觀的了解骨折后骨演變及膠原與新骨生長(zhǎng)情況［5-6］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，愈骨膠囊組軟骨細(xì)胞增生明顯、數(shù)目較多，軟骨骨痂形成較早，鈣化提前，纖維性骨痂、軟骨島、編織骨及皮質(zhì)骨出現(xiàn)均較模型組早，骨折端塑形改造良好，髓腔再通時(shí)間縮短。生物力學(xué)測(cè)定結(jié)果也表明，愈骨膠囊能增加兔橈骨骨折后的最大載荷，最大位移和彈性模數(shù)。

表6 愈骨膠囊對(duì)骨痂TGF-β表達(dá)光密度的影響(，n=5)Tab.6 Effect of Yugu Capsules on expression of TGF-β in callus(，n=5)

表6 愈骨膠囊對(duì)骨痂TGF-β表達(dá)光密度的影響(，n=5)Tab.6 Effect of Yugu Capsules on expression of TGF-β in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 2周 4周 6周正常組0.0373±0.0028 0.0373±0.0028 0.0373±0.0028模型組 0.0455±0.0030* 0.0413±0.0034 0.0405±0.0036接骨七厘片組 0.0403±0.0054# 0.0573±0.0040# 0.0506±0.0032#愈骨膠囊組 0.0412±0.0014 0.0649±0.0036# 0.0487±0.0042#

圖3 骨痂組織的TGF-β表達(dá)情況(10×10)Fig.3 Expression of TGF-β in callus(10×10)

表7 愈骨膠囊對(duì)骨痂VEGF表達(dá)光密度的影響(，n=5)Tab.7 Effect of Yugu Capsules on expression of VEGF in callus(，n=5)

表7 愈骨膠囊對(duì)骨痂VEGF表達(dá)光密度的影響(，n=5)Tab.7 Effect of Yugu Capsules on expression of VEGF in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 第2周 第4周 第6周正常組0.0398±0.0041 0.0398±0.0041 0.0398±0.0041模型組 0.0621±0.0065* 0.0582±0.0026* 0.0536±0.0044*接骨七厘片組 0.0522±0.0026# 0.0939±0.0140# 0.0566±0.0052愈骨膠囊組 0.0507±0.0026# 0.0823±0.0076#0.0504±0.0027

圖4 骨痂組織的VEGF表達(dá)情況(10×10)Fig.4 Expression of VEGF in callus(10×10)

文獻(xiàn)報(bào)道，局部的血液供應(yīng)是影響骨折愈合的最根本因素，一切影響血液供應(yīng)的因素都會(huì)影響骨折愈合，而血管的形成在骨折愈合中起著重要的新生作用，也是支持成骨細(xì)胞成骨所必需［7-8］。TGF-β有誘導(dǎo)和增強(qiáng)骨形成的作用，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并對(duì)新合成基質(zhì)的降解具有顯著的抑制作用，還能增加血管的形成［9-10］。VEGF具有增加微血管通透性，特異性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖，進(jìn)而導(dǎo)致新生血管生成等生物學(xué)特性，是最有力的血管生成因子，其他血管生成因子的血管生成作用全部或部分通過(guò)增強(qiáng)VEGF的表達(dá)及生成作用來(lái)實(shí)現(xiàn)［11-12］;VEGF也可以促進(jìn)軟骨骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)化的過(guò)程［13］。與模型組相比，愈骨膠囊能增強(qiáng)骨痂組織內(nèi)TGF-β和VEGF表達(dá)，且在第4周時(shí)作用最強(qiáng)。推測(cè)愈骨膠囊促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能與增強(qiáng)骨折前、中期骨痂組織中TGF-β和VEGF表達(dá)，從而完善骨痂內(nèi)微血管重建，加快骨折斷端塑形過(guò)程有關(guān)。

研究愈骨膠囊對(duì)TGF-β和VEGF蛋白表達(dá)的影響，有利于探討愈骨膠囊促進(jìn)骨折愈合的可能機(jī)制。但是，參與骨形成與修復(fù)過(guò)程中的重要細(xì)胞因子還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，成纖維細(xì)胞因子(FGF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)等［14-15］。因此，在以后研究中有必要對(duì)愈骨膠囊促進(jìn)骨折愈合的分子機(jī)制進(jìn)行全面深入研究，為愈骨膠囊研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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