靜電紡絲法構(gòu)建食道上皮組織

陳玲，呂靜靜，於學(xué)禪，康騁，竺亞斌

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211

食道是消化道中很重要的一個(gè)組成部分，擔(dān)負(fù)著將水和食物從口咽部輸送至胃部的功能。可是全世界因食道病變引起的新發(fā)病患及死亡病患正逐年增加，其中發(fā)病情況最為嚴(yán)峻的是食道癌[1]。據(jù)研究 90%的食道癌發(fā)生在食道上皮組織，由鱗狀上皮細(xì)胞變異所致；另外約 10%的腺癌先由鱗狀上皮變異為含腺體上皮然后再演變成食管腺癌的[2-3]。從上面來(lái)看，上皮組織變異是導(dǎo)致食道癌發(fā)生的主要原因之一，因此構(gòu)建工程化食道上皮替代病變組織顯得尤為重要。

聚乳酸 (PLA)是 FDA認(rèn)可的具有良好生物相容性和降解性的生物材料，在組織工程中被廣泛用于骨、軟骨、人造皮膚、周?chē)窠?jīng)等的支架基材[4-6]。但是由于疏水性和細(xì)胞惰性導(dǎo)致其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定限制[7]。人們對(duì)PLA進(jìn)行了一些改性研究，如加入殼聚糖、明膠等天然生物大分子[8-9]或與聚乙醇酸、聚多巴胺等親水性高分子[10-11]共混或共聚來(lái)提高其親水性及細(xì)胞相容性。我們實(shí)驗(yàn)室則將PLA與絲素蛋白 (SF)結(jié)合使用以期克服 PLA的這些缺陷。絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種天然生物大分子，作為手術(shù)縫線用于臨床已有 100多年的歷史。組成絲素蛋白的氨基酸主要是極性氨基酸，能為細(xì)胞提供結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)機(jī)體細(xì)胞粘附力強(qiáng)，且具有緩慢降解性以及良好的力學(xué)性能和氧氣滲透性[12-14]。

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)支持上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的基膜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及含量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)基膜由納米纖維相互交織而成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維直徑從28到165 nm，平均為 (66±24)nm，基膜厚度從53到151 nm，平均 (86±15)nm，主要成分是IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白及蛋白聚糖等[15]。本文根據(jù)上皮細(xì)胞與基膜相互作用、相互依存的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將 PLA和 SF共混紡絲，制備PLA/SF電紡支架，并將從豬食道中提取的基膜蛋白混合液涂覆接枝其上，以期構(gòu)建具有天然構(gòu)造的食道上皮組織，為將來(lái)替代或修復(fù)病變食道上皮組織提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

聚乳酸 (PLA，Mn 300 kDa，寧波環(huán)球生物材料有限公司)；蠶絲 (寧波市江東吉達(dá)貿(mào)易有限公司)；三氟乙酸 (TFA，上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司)；DMEM、Dispase、AAS (100 U/mL penicillin，100 U/mL streptomycin，0.25 g/mL amphotericin B)、FBS (Gibco公司，美國(guó))；鼠抗人角蛋白 14抗體 (CK14，Santa Cruz Biotechnology)；FITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG (北京奧博森生物科技公司)；4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)；所有用于Western blotting實(shí)驗(yàn)的試劑購(gòu)于碧云天生物試劑研究所；其余試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，本實(shí)驗(yàn)所使用的水均為去離子水。

1.2 絲素蛋白 (SF)的提取

將蠶絲剪碎，置于0.5% Na2CO3水溶液中煮沸1 h，用水反復(fù)沖洗干凈蠶絲表面的絲膠，烘干。取脫膠后的蠶絲與Ca2(NO3)2·4H2O共混，其浴比為蠶絲：Ca2(NO3)2·4H2O=1∶20，80 ℃水浴溶解1.5 h，用水透析3 d，每4 h換水1次，使用 20 000分子量的聚乙二醇濃縮至低含水量，冷凍真空抽干，得海綿狀絲素蛋白，備用。

1.3 電紡絲支架的制備

將PLA溶于二氯甲烷及二甲基甲酰胺 (DMF)混合液 (3∶2，V∶V)中，PLA、SF 按比例 (1∶2，W∶W)溶于三氟乙酸中，制備成濃度為 0.10～0.25 g/mL的PLA、PLA/SF電紡液，利用本實(shí)驗(yàn)室自制的靜電紡絲系統(tǒng)[15]進(jìn)行電紡，通過(guò)調(diào)節(jié)電壓10～25 kV、接收距離7～11 cm以及流速0.2～1.5 mL/h，得到不同形態(tài)的纖維膜，在光鏡下觀察電紡纖維的尺寸是否均勻，是否有液滴產(chǎn)生，確定電紡條件。利用錫紙和玻片 (Ф14 mm)作為承載電紡絲纖維的載體，其中錫紙載體是為了進(jìn)行纖維支架表征，玻片是為了檢測(cè)細(xì)胞相容性，收集的纖維膜室溫晾干后，置于 4 ℃保存，備用。

1.4 豬食道基膜蛋白的提取與支架上的涂覆接枝

從屠宰場(chǎng)獲得豬食道粘膜及粘膜下層，洗凈，剪碎，依次浸入以下溶液中低溫勻漿，1) 3.4 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，蛋白酶抑制劑(2 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L N-甲基馬來(lái)酰亞胺)；2)0.5 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，蛋白酶抑制劑。勻漿液低溫離心 (8 000 r/min，20 min)，取上清液存于-70 ℃，備用[16]。

將上述制備的PLA電紡支架置于24孔培養(yǎng)板中，每孔滴加300 μL蛋白提取液，4 ℃冰箱放置24 h，PBS清洗3次，去除多余蛋白，真空凍干后4 ℃冷藏，備用。

1.5 電紡絲支架的表征

1.5.1 掃描電鏡觀察

將電紡纖維膜利用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，表面噴金 (E-1010，Hitach)80 s后在掃描電鏡 (SEM)(S-3400N，Hitach)下觀察纖維的形態(tài)并拍照。利用Image J圖像分析軟件對(duì)電鏡圖像進(jìn)行分析，每個(gè)樣品選取3張SEM圖片，每張圖片至少對(duì)30根纖維進(jìn)行直徑的測(cè)量，纖維直徑用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示。

1.5.2 力學(xué)性能測(cè)試

將電紡纖維膜裁成測(cè)試有效長(zhǎng)度為2 cm，寬度1 cm的啞鈴狀，利用測(cè)厚儀測(cè)得樣品厚度在0.1～0.3 mm之間，每組纖維膜取3個(gè)樣品，在力學(xué)測(cè)試儀 (3 366，Instron)上以1 mm/min的加載速度施加應(yīng)力進(jìn)行拉伸測(cè)試，測(cè)試結(jié)果取平均值。

1.5.3 降解性能測(cè)試

備用電紡纖維膜用75%的酒精浸泡2 h消毒處理后，再用滅菌PBS進(jìn)行漂洗，最后浸入含100 U/mL雙抗的PBS (pH 7.4)溶液中，37 ℃水浴，按1 d、3 d、7 d、15 d、30 d、60 d等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。取出的樣品用蒸餾水洗滌干凈，真空抽干后稱重。每組支架每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取 3個(gè)平行樣品，取平均值。按下列公式計(jì)算失重率：

其中，Wl代表失重率 (%)；W0代表原重；Wr代表余重。

1.6 支架細(xì)胞相容性研究

1.6.1 支架的預(yù)處理

75%酒精浸泡電紡纖維膜支架4 h，PBS置換去凈酒精，DMEM培養(yǎng)基浸泡0.5 h后吸去多余培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中，待接種細(xì)胞。

1.6.2 上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及支架上種植

取屠宰場(chǎng)現(xiàn)宰新鮮豬食管3～4 cm，沿縱軸切開(kāi)后，修剪去除肉眼可見(jiàn)的粘膜下組織，以含100 U/mL雙抗的PBS溶液輕輕刮洗粘膜上層表面，95%酒精沖洗1次，75%酒精沖洗1次，1%次氯酸鈉輕輕刮洗1 min，PBS清洗3次，浸入含100 U/mL雙抗的PBS中帶回。實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)中，5%碘伏浸泡3 min，PBS清洗干凈；然后將標(biāo)本浸入50 mg/mL Dispase分離酶消化液(PBS配制)，4 ℃過(guò)夜，使鱗狀上皮細(xì)胞層與基底的間質(zhì)層分離。隨后將上皮層剪碎，用胰蛋白酶在37 ℃水浴條件下消化10 min，將鱗狀上皮細(xì)胞層分離為單細(xì)胞懸液，用等量含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打均勻，棄去組織碎塊，1 500 r/min離心5 min，棄上清，含100 U/mL AAS的完全培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，接種在培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)箱中 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h第1次換液，然后每隔4 d換液1次，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右后用胰蛋白酶消化，按1∶2分瓶傳代。取2～4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 支架上細(xì)胞形態(tài)觀察

0.25 %胰蛋白酶消化培養(yǎng)中上皮細(xì)胞，利用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2.6×104cells/cm2的密度種植于聚苯乙烯 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (TCPS)中的電紡纖維膜支架上。14 d后終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗干凈，2.5%戊二醛水溶液室溫固定0.5 h，PBS清洗 3次，蒸餾水清洗 3次，經(jīng)酒精系列梯度脫水 (30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%、95%、100%、100%)，室溫真空干燥，樣品噴金后，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的粘附及鋪展情況。

1.6.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞粘附與增殖

將上皮細(xì)胞種植支架上，分別培養(yǎng)2 d、7 d、14 d的細(xì)胞支架培養(yǎng)物為實(shí)驗(yàn)組，未鋪加支架的 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (TCPS)為對(duì)照組。通過(guò)MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞粘附增殖情況：每孔加入MTT (0.5 mg/mL)溶液 40 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，小心棄去上清液，保留底部藍(lán)色結(jié)晶，每孔再加入400 μL二甲基亞砜 (DMSO)，吹打均勻，并對(duì)應(yīng)移至另一空96孔板，在490 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀 (MaxM5，Spectra)測(cè)定各孔的吸光度值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并測(cè)試3次，取平均值。

1.6.5 免疫熒光分析

細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，吸棄24孔板中的培養(yǎng)基，PBS清洗3次；4%多聚甲醛室溫固定30 min；0.1% Triton X-100破膜10 min，PBS清洗3次，每次10 min；羊血清室溫封閉1 h，吸干血清；加入一抗 CK14 (鼠抗人，按1∶100稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3次，每次10 min；異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的二抗 (羊抗鼠，按 1∶100稀釋)室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min；4',6'-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI，3 mg/mL)浸染10 min，PBS清洗3次，每次10 min。使用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，立即在激光共聚焦顯微鏡 (FV-1000，Olympus)下進(jìn)行熒光觀察及拍照。

1.6.6 Western blotting分析

細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次，用含有單去污劑 (PMSF)的蛋白裂解液(RIPA)抽提蛋白，冰上裂解30 min，將蛋白液吸至EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清。將25 μL蛋白提取液加入5%濃縮膠，電泳槽 (Mini-protean tetra system, Bio-RAD)接通電源，起始電壓80 V，待溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入12%分離膠后調(diào)整電壓為100 V。電泳結(jié)束后，80 V恒定電壓轉(zhuǎn)膜1.5 h。隨后，把PVDF膜浸泡在含 5%脫脂奶粉的 TBS-T溶液中，室溫封閉1 h。將PVDF膜置于CK14角蛋白 (封閉液稀釋1∶200)溶液中，在搖床上室溫孵育1 h。TBS-T洗膜3次。然后將PVDF膜用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠-IGg二抗 (1∶2 000封閉液稀釋)室溫孵育1 h，洗膜。暗室中，底片曝光、顯影、定影，掃描成圖，利用Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電紡支架的表征

2.1.1 支架的纖維特征

在靜電紡絲過(guò)程中，纖維形態(tài)的影響因素有很多，如溶液濃度、溶劑、電壓、接收距離、溶液流速、以及周?chē)h(huán)境等[17-20]。本文中所使用的電紡設(shè)備為本課題組自行研制、設(shè)計(jì)，在參考了以前的實(shí)驗(yàn)成果的基礎(chǔ)上[21-23]，通過(guò)不斷調(diào)整紡絲條件，并經(jīng)過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)電紡纖維的觀察，確定最佳電紡絲參數(shù) (表1)。

高分子聚合物溶液通過(guò)靜電紡絲法制成纖維膜的有利條件是對(duì)纖維直徑的可控性。SEM觀察電紡纖維的表面形貌如圖 1所示，PLA和PLA/SF在上述紡絲條件下均形成了纖維，表面上也沒(méi)有明顯的液珠，纖維之間孔隙較大，連通性好，這樣的結(jié)構(gòu)在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)有利于營(yíng)養(yǎng)液的流通和代謝物的排出[24]。通過(guò)Image J軟件的分析，得到兩組支架的纖維直徑 (表2)，PLA和PLA/SF的纖維直徑均分布在200至400 nm之間，而且絲素蛋白的加入使電紡絲纖維的平均直徑明顯下降。

表1 PLA和PLA/SF電紡絲參數(shù)Table 1 Electrospinning parameters for PLA and PLA/SF scaffold

圖1 多孔纖維支架掃描電鏡圖Fig. 1 Scaffold morphology observed under SEM. (a)PLA. (b)PLA/SF.

表2 電紡絲支架的纖維直徑及力學(xué)性能參數(shù)Table 2 Quantitative results of scaffold’s diameter(nm)and mechanical properties

2.1.2 支架的力學(xué)性能

組織工程支架除了要給種子細(xì)胞提供足夠的生長(zhǎng)空間外，還要在細(xì)胞尚未形成組織之前，能為細(xì)胞提供一定的支撐且承受再生組織及周邊組織、器官及細(xì)胞等微環(huán)境帶來(lái)的張力；因此體外構(gòu)建的支架不僅要求具有一定的強(qiáng)度，還要具有一定的柔軟度，以利于細(xì)胞在其上進(jìn)行遷移運(yùn)動(dòng)。圖2為PLA、PLA/SF纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。支架的最大應(yīng)力 (ó)、最大應(yīng)變 (ε)及楊氏模量 (E)見(jiàn)表 2。PLA 纖維膜的最大應(yīng)力為(1.8±0.2)MPa，在應(yīng)變?yōu)?(11.2±1.2)%時(shí)出現(xiàn)屈服，有局部斷裂發(fā)生。PLA與 SF共紡所得的PLA/SF纖維膜的最大應(yīng)力為 (2.4±0.4)MPa，高于PLA。這是可以理解的，因?yàn)镾F本身具有很好的機(jī)械強(qiáng)度，素有生物鋼美稱，SF和PLA共紡所得纖維其機(jī)械強(qiáng)度也因此得到提升。另外，PLA/SF在達(dá)到最大應(yīng)變 (13.4±0.9)% 時(shí)發(fā)生斷裂。從上來(lái)看，PLA/SF的應(yīng)力和應(yīng)變與豬食道脫細(xì)胞后的粘膜及粘膜下層基質(zhì)的力學(xué)性能 (拉升應(yīng)力 (2±0.84)MPa)[25]相近。因此，我們認(rèn)為 PLA/SF電紡絲支架在力學(xué)性能上可以滿足作為構(gòu)建食道上皮的支架要求。

2.1.3 支架的降解性能

圖2 電紡支架材料的力學(xué)性能Fig. 2 Tensile stress-strain curve of electrospinning scaffolds. 1: PLA; 2: PLA/SF.

細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)的過(guò)程中，支架的降解速率必須與細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相吻合，過(guò)快或者過(guò)慢均會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[26-27]。支架的降解性主要取決于構(gòu)成支架的材料的降解性：對(duì)于聚合物來(lái)說(shuō)，它的降解包括聚合物本身分子鏈逐漸斷裂而生成低聚物、低分子量降解產(chǎn)物甚至單體及低分子量降解產(chǎn)物所有的化學(xué)過(guò)程[28]。所以影響聚合物降解的因素有很多，如：聚合物本身的化學(xué)性質(zhì)如組成成分、分子鏈間的相互作用、材料的親/疏水性以及結(jié)構(gòu)參數(shù)如外形、結(jié)晶度、取向程度、表面結(jié)構(gòu)等[29-31]。實(shí)驗(yàn)證明，可降解聚合物在體內(nèi)、體外的降解規(guī)律具有很好的相似性，支架在體外的降解情況能為組織工程支架體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的降解情況提供參考依據(jù)[32-34]。本實(shí)驗(yàn)將支架浸于PBS (pH 7.4，相當(dāng)于生理鹽水)溶液中，以60 d為測(cè)試周期，檢測(cè)支架的質(zhì)量損失為計(jì)量指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)支架體外降解率，如圖 3所示。PLA/SF和PLA的降解趨勢(shì)非常接近，在7 d以前支架降解速率變化不甚明顯，在7～30 d之間，支架的 PLA降解速率急劇升到達(dá) 17.4%后又趨于平緩。但是降解率60 d時(shí)達(dá) (20.4±0.9)%，相較于之前Vieira等的研究稍有增大。他們發(fā)現(xiàn)從第2周開(kāi)始，支架的質(zhì)量損耗就有大幅增加，達(dá)到20%左右[35]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

圖3 電紡支架PLA和PLA/SF的質(zhì)量損失隨時(shí)間的變化Fig. 3 Weight loss (%)of PLA and PLA/SF as a function of time. Scaffolds was immersed in PBS (pH 7.4)supplemented with 100 U/mL Penicillinstreptomycin at 37 ℃.

2.2 電紡支架的細(xì)胞相容性

組成上皮組織的上皮細(xì)胞是生長(zhǎng)在基膜上的復(fù)層未角化的鱗狀上皮細(xì)胞，呈連續(xù)性片狀構(gòu)造，而這一層基膜雖然只有幾十納米的厚度，卻對(duì)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及功能分化起著非常重要的作用。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)基膜是由IV型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白及蛋白聚糖等組成的納米纖維交織而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。為了提高高分子復(fù)合材料的生物相容性為了提高支架的相容性，很多研究工作是在人工支架上接枝膠原蛋白[36-39]，其中的Ⅳ型膠原蛋白起促使上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移至表皮形成粘膜層的作用。但是它僅僅是食道粘膜基層蛋白中的一種，因此我們從豬食道粘膜組織中提取了基膜的蛋白液，并將其包被于PLA的電紡絲纖維上，希望提高支架的上皮細(xì)胞相容性 (圖4)。檢測(cè)其上上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，同時(shí)將PLA和PLA/SF (圖1)作為對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基膜蛋白提取液接枝的PLA支架與空白PLA支架相比，纖維稍有變粗、鈍化，孔尺寸稍小，但是更加平滑。

圖4 coated-PLA支架掃描電鏡圖Fig. 4 SEM picture of coated-PLA scaffold.

上皮細(xì)胞是一種貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，其活性的不同與纖維支架中的纖維形態(tài)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)以及化學(xué)組成相關(guān)[40]。因此我們可以通過(guò)檢測(cè) 3種支架上細(xì)胞的粘附及增殖能力的不同來(lái)評(píng)斷支架細(xì)胞相容性的優(yōu)劣。我們將豬F3上皮細(xì)胞分別種植于PLA、PLA/SF和 coated-PLA三種電紡絲支架上一定時(shí)間后對(duì)其細(xì)胞型貌和粘附增殖情況進(jìn)行檢測(cè)。

從培養(yǎng)14 d的掃描電鏡圖可以看出上皮細(xì)胞在 3種支架上均有一定的粘附和增殖。但是在PLA支架上上皮細(xì)胞生長(zhǎng)密度較低，未連接成片 (圖5a，箭頭)；PLA/SF支架上上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況較PLA稍好 (圖5b)；coated-PLA支架上上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)密度不僅遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PLA、PLA/SF支架 (圖5c)，而且細(xì)胞與支架纖維融為一體連接細(xì)胞呈鋪路石狀緊密排列 (圖5c2)，與原代上皮細(xì)胞相同[41]，這樣支架更有利于細(xì)胞的粘附以及細(xì)胞間作用。

圖5 上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在支架上的掃描電鏡圖Fig. 5 Cell morphology observed under SEM. ECs were seeded on the scaffolds of PLA (a), PLA/SF (b)and coated-PLA (c). 1 and 2, different magnification. Cells were seeded at the density of 2.6′104 cells /cm2and cultured for 14 d at 37 ℃ in humidified air with 5% CO2 (The same conditions were followed for all cell culture).

上皮細(xì)胞本身緊密連接呈連續(xù)性片狀生長(zhǎng)，并被基底膜所支撐；而在離體培養(yǎng)時(shí)，通常比其他種類的細(xì)胞更難粘附于體外基底材料。在檢測(cè)上皮細(xì)胞線粒體活性隨時(shí)間變化的14 d中，我們以第2 天的細(xì)胞活性反映細(xì)胞在支架上的粘附率，PLA作為負(fù)對(duì)照，TCPS作為正對(duì)照。圖6顯示上皮細(xì)胞在PLA、PLA/SF、coated-PLA支架上的粘附率依次升高，雖然不及 TCPS，但是 coated-PLA支架上的細(xì)胞活性相較PLA支架提高了很多。在7 d及14 d時(shí)coated-PLA支架上的上皮細(xì)胞活性是3種支架中最好的，PLA/SF次之。這說(shuō)明涂覆接枝在支架上的基膜蛋白提取液對(duì)上皮細(xì)胞具有明顯的支持作用，這可能是因?yàn)樘崛∮谑车赖幕さ鞍捉o細(xì)胞提供了一個(gè)類似于與體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，大大促進(jìn)了上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。其次，來(lái)自于動(dòng)物體的絲素蛋白的存在也對(duì)提高支架的細(xì)胞相容性具有促進(jìn)作用，這些結(jié)果與 SEM所觀察到的結(jié)果也是一致的。

圖6 細(xì)胞活性隨時(shí)間的變化Fig. 6 Mitochondrial activity of epithelial cells as a function of culture time.

2.3 免疫組化分析

食道上皮層組織由里(靠近基膜)及外(內(nèi)腔)依細(xì)胞分化程度可以分為基底層、棘層及角質(zhì)層 3層。外層角質(zhì)層細(xì)胞高度分化呈多角形，其胞質(zhì)中含有大量角蛋白絲，具有很好的機(jī)械性能如耐磨、耐穿刺等，在不斷脫落的同時(shí)，自我修復(fù)能力也比較強(qiáng)。棘層細(xì)胞較肥大，胞漿較豐富。而基底層細(xì)胞屬新生上皮，細(xì)胞擁擠，體積圓潤(rùn)小巧，排列與鋪路石相似，分布于正常食管粘膜上皮基底層和基底旁細(xì)胞層，其功能是增殖分化以修補(bǔ)外兩層細(xì)胞的損失、脫落。從豬食道粘膜分離得到的上皮細(xì)胞呈現(xiàn)了鋪路石狀的上皮細(xì)胞型貌 (圖7a2，b2，c2)。

圖7 種植在支架上的上皮細(xì)胞CK14角蛋白免疫熒光圖Fig. 7 Immunofluorescences of epithelial cells seeded on scaffolds. Anti-keratin CK14 was used as the primary antibody. The nuclei were stained with DAPI to display blue (1)and the keratin was stained with anti-CK14 to display green (2). (3)is the composite of (1)and (2). (a)PLA, (b)PLA/SF and (c)coated-PLA.

角蛋白作為上皮細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)蛋白，是上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志性產(chǎn)物[42]。其中，CK14角蛋白僅在基底層上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)[43]，可以用來(lái)作為基底層上皮細(xì)胞的鑒定，其在胞質(zhì)中的含量是細(xì)胞增殖活力的一個(gè)評(píng)判指標(biāo)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)14 d的培養(yǎng)，以單克隆抗體CK14免疫染色細(xì)胞質(zhì)，DAPI染細(xì)胞核，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖活力，其中藍(lán)色 (1)為細(xì)胞核，綠色 (2)為CK14蛋白染色，(3)是二者的復(fù)合。圖 7可以看出多數(shù)細(xì)胞均有少量CK14蛋白的表達(dá)，說(shuō)明在支架上種植的細(xì)胞確為上皮細(xì)胞，且活性較好，分化未完全，具有很好的增殖能力。通過(guò)藍(lán)色細(xì)胞核的計(jì)數(shù)，各支架表面生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞密度由低到高依次為PLA (圖 7a)、PLA/SF (圖 7b)、coated-PLA (圖7c)。這一結(jié)果與MTT法測(cè)得的細(xì)胞增殖率結(jié)果一致。

圖8 Western blotting測(cè)定支架上細(xì)胞的CK14角蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig. 8 Relative quantification of CK14 expressed by epithelial cells cultured on different scaffolds using Western blotting technology. (a)The stripes from left to right represent the CK14 expression of cells on PLA,PLA/SF, coated-PLA scaffolds and TCPS, respectively.Cells were cultured in vitro for 14 d. (b)Quantitative analysis of CK14 (results were relatively percented by TCPS). P values less than 0.05 were considered to be significant.

運(yùn)用Western blotting技術(shù)對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞其 CK14角蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè) (圖 8)。由左至右的灰條帶分別代表 CK14角蛋白在PLA、PLA/SF、coated-PLA支架及 TCPS上的表達(dá)量 (圖8a)。條帶的顏色逐漸加深，表明蛋白量逐漸增加，PLA上細(xì)胞的 CK14角蛋白量最少，PLA/SF上次之，coated-PLA上細(xì)胞的CK14角蛋白是這3種支架中最多的。定量分析后 (圖8b)顯示，上皮細(xì)胞在coated-PLA支架上和在PLA/SF上表達(dá)的CK14角蛋白量均明顯比在 PLA支架上的表達(dá)量多。這說(shuō)明細(xì)胞在coated-PLA和 PLA/SF兩種支架上的增殖能力強(qiáng)于PLA支架。

3 結(jié)論

我們以PLA為基材，利用靜電紡絲技術(shù)，模擬食道基膜結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了PLA及PLA/SF兩種納米纖維多孔支架。經(jīng)纖維形態(tài)、力學(xué)行為、降解等性能檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PLA/SF電紡纖維膜纖維結(jié)構(gòu)更趨近于基膜結(jié)構(gòu)，且機(jī)械性能更好；通過(guò)MTT、免疫熒光、Western blotting等方法檢測(cè)支架與上皮細(xì)胞的作用情況，表明PLA/SF具有與原代上皮細(xì)胞較好的相容性。從豬食道粘膜中提取基膜蛋白液并將其涂覆接枝于PLA支架纖維表面后，上皮細(xì)胞的粘附和增殖得到了明顯提高；而且體外培養(yǎng)14 d后仍然維持CK14蛋白的表達(dá)功能，我們認(rèn)為基膜蛋白的包被可以提供給體外培養(yǎng)的細(xì)胞以類似體內(nèi)的生長(zhǎng)微環(huán)境，有助于上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能分化。目前，我們正在嘗試將上皮組織的電紡絲纖維支架與肌組織的構(gòu)建相結(jié)合，為最終構(gòu)建出具有完善形狀和功能的組織工程化食道提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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