樹(shù)突狀細(xì)胞核蛋白1的核定位信號(hào)鑒定

陶瑞松，徐忠東，王 偉

（合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 合肥230601）

重性抑郁障礙(major depressive disorder，MDD）,又稱(chēng)重性抑郁癥，是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重的精神類(lèi)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未明確。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，重性抑郁障礙發(fā)病呈逐年上升的趨勢(shì)，如浙江省的MDD 患病率已達(dá)4.3%。[1]該疾病的典型癥狀為長(zhǎng)期心境抑郁，對(duì)曾經(jīng)感到有趣的活動(dòng)喪失興趣，對(duì)患者的正常生活造成嚴(yán)重影響。[2]在美國(guó)型患者自殺幾率約為3.4%，而且近60%的人患有其他心境障礙。因而重性抑郁障礙是一種致殘性的疾病，嚴(yán)重影響人們的身體、精神和活動(dòng)，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。

樹(shù)突狀細(xì)胞核蛋白1（DCNP1），由244 個(gè)氨基酸組成，分子量為27kD,定位于人染色體5q31 區(qū)的外顯子，主要在腦和骨骼肌中表達(dá)；在成熟的樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)定位于細(xì)胞核的核周。[3，4]由于DCNP1 分子量較小，理論上應(yīng)該可以自由出入細(xì)胞核，因而我們認(rèn)為DCNP1 分子上應(yīng)該存在定位于核內(nèi)的核定位信號(hào)序列。近年研究發(fā)現(xiàn)DCNP1 蛋白的117 位氨基酸表達(dá)的提前終止所形成的突變體會(huì)增加MDD 發(fā)病的危險(xiǎn)，因而認(rèn)為DCNP1 是MDD 發(fā)病的一個(gè)潛在候選基因。[5]本研究通過(guò)對(duì)DCNP1 序列的分析和實(shí)驗(yàn)的方法鑒定DCNP1 的核定位信號(hào)序列。

1 材料和方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pEGFP-N1 購(gòu)自Clontech,Mutanbest突變?cè)噭┖袨門(mén)AKARA 公司產(chǎn)品;Lipofectamine2000、DMEM、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen;倒置熒光顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位在本校實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 載體的構(gòu)建

野生型DCNP1 的綠色熒光融合蛋白的構(gòu)建:以人胚胎腎293 細(xì)胞全細(xì)胞RNA 抽提物為模板，使用上游引物5’-GAGTCGACACTATGCATTACGGAGCA-3’和下游引物5’-TTGGATCCAACTCAGGCACGTGGGCTG-3’，采用RT-PCR 擴(kuò)增DCNP1 編碼序列，經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆到綠色熒光蛋白pEGFP-N1 構(gòu)建成pEGFP-N1-DCNP1。

DCNP1 氨基端突變體（DCNP11-116）的綠色熒光融合蛋白構(gòu)建：以DCNP1 為模板，使用上游引物5’-GAGTCGACACTATGCATTACGGAGCA-3’，和下游引 物5’ -CTGGATCCTTGCTGCTATGCAGTTC -3’,采用PCR 擴(kuò)增得到重組的突變體DCNP11-116。經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆到綠色熒光蛋白pEGFP-N1 構(gòu)建成pEGFP-N1-DCNP11-116。

DCNP1 羧基端突變體（DCNP1117-244）的綠色熒光融合蛋白構(gòu)建：DCNP1 為模板,使用上游引物5’-GAGTCGACGATGAGAAGGAAGACAGGC-3’和下游引物5’-TTGGATCCAACTCAGGCACGTGGGCTG-3’, 采 用PCR 擴(kuò)增得到重組的突變體DCNP1117-244。經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后克隆到綠色熒光蛋白pEGFPN1 構(gòu)建成pEGFP-N1-DCNP11-116。

DCNP1 刪除第117-119 位氨基酸殘基的突變體的綠色熒光融合蛋白的構(gòu)建：根據(jù)TAKARA 公司突變?cè)噭┖姓f(shuō)明，以pEGFP-N1-DCNP1 為模板，使用上游引物5’-GCTGCTATGCAGTTCATCCTG-3'和下游引物5’-ACAGGCCAGACCAGGCGGGAG-3' 采用PCR 擴(kuò)增得到重組的突變體pEGFP-N1-DCNP1Δ117-119。

所有構(gòu)建的重組質(zhì)粒都經(jīng)過(guò)上海生工測(cè)序驗(yàn)證，野生型及突變型DCNP1 與GFP 融合蛋白的重組結(jié)構(gòu)示意圖，如圖1。

圖1 野生型及突變型DCNP1 與GFP融合蛋白的重組結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)

用含有10%胎牛血清的DMEM （Invitrogen）培養(yǎng)293FT 細(xì)胞過(guò)夜，將細(xì)胞用Opti-MEM 清洗后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。使用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑盒在無(wú)血清的DMEM 中轉(zhuǎn)染各種質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染6h 后換含有10%的胎牛血清的DMEM 的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后通過(guò)倒置熒光顯微鏡放大40 倍進(jìn)行觀察。

2 結(jié) 果

為了觀察野生型DCNP1 以及各種突變型DCNP1 的亞細(xì)胞定位特性，我們構(gòu)建了pEGFPN1-DCNP1，pEGFP-N1-DCNP11-116，pEGFP-N1-DCNP1117-244和pEGFP-N1-DCNP1Δ117-119。然后將這些質(zhì)粒在293FT 細(xì)胞中分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染36h 以后，帶有熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞通過(guò)倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示野生型DCNP1 如預(yù)期一樣定位于細(xì)胞核的核周，然而DCNP11-116喪失了核定位的特性，隨機(jī)分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中；DCNP1117-244還分布與核內(nèi)；而缺失了第117-119 位氨基酸殘基的DCNP1 突變體同樣喪失了原有的核定位的特性，只分布于細(xì)胞質(zhì)中，如圖2。

圖2 野生型及突變型DCNP1 與綠色熒光蛋白（GFP）重組后的亞細(xì)胞定位

3 討 論

細(xì)胞核的核孔復(fù)合體能夠允許水溶性小分子物質(zhì)進(jìn)入或輸出核膜，運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)包括出核的RNA、核糖體以及進(jìn)核的蛋白質(zhì)、碳水化合物和信號(hào)分子等物質(zhì)。[6]顯而易見(jiàn)小分子物質(zhì)可以通過(guò)擴(kuò)散作用通過(guò)核孔復(fù)合體，而大分子物質(zhì)可能要被特異的信號(hào)序列識(shí)別后在核孔蛋白的幫助下出入細(xì)胞核。[7,8]核定位信號(hào)序列正是這樣一類(lèi)氨基酸序列，它將蛋白質(zhì)標(biāo)記后通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入核內(nèi)。因而任何一種帶有核定位信號(hào)的蛋白均可以有效地通過(guò)核孔復(fù)合體進(jìn)入核內(nèi)。[9]

DCNP1 蛋白由244 個(gè)氨基酸組成，主要分布與核周。在293FT 細(xì)胞中DCNP1117-244的分布與DCNP1 基本一致，分布于核內(nèi)。然而第117-119 位氨基酸殘基缺失的DCNP1 突變體卻喪失了原有的核定位的功能，只存在于細(xì)胞質(zhì)中。甚至DCNP11-116由于117 位之后的氨基酸的缺失導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都有分布。對(duì)照DCNP1 蛋白的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)第117-119 位氨基酸分別是賴(lài)氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸，而核定位信號(hào)通常由一段富含賴(lài)氨酸、精氨酸等氨基酸的短肽組成，具有高度通透性，介導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)。[10]因此我們認(rèn)為第117-119位氨基酸序列是DCNP1 蛋白的核定位信號(hào)序列，其117 位氨基酸翻譯的終止改變了其亞細(xì)胞定位。并且117 位氨基酸翻譯的提前終止增加了MDD 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，所以我們推測(cè)DCNP1 細(xì)胞定位的改變可能在MDD 發(fā)病中有一定的關(guān)聯(lián)作用。

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