電位滴定法測定苦瓜中總生物堿的含量*

石雪萍，汪洪濤，余芳，陳成

(江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 南京，210007)

苦瓜(英文名:bitter melon，bitter gourd;拉丁名:Momordica charantiaL. )為葫蘆科苦瓜屬植物，性味苦寒，因味苦得名?？喙喜粌H含有人體必需的營養(yǎng)成分，還含有其他功效成分而具有清熱解涼、滋養(yǎng)強(qiáng)壯、降血糖等功效［1］。

生物堿是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機(jī)化合物，有似堿的性質(zhì)。苦瓜中也含有生物堿成分。1990 年，Handa 等［2］從脫脂苦瓜中分離出一種具有降血糖活性的乙二醇-生物堿——蠶豆苷。肖志艷等［3］用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇對新鮮苦瓜熱浸提取，濃縮提取液以氯仿-水分配，將氯仿層蒸干得干膏，該部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析可分離得到β-谷甾醇(β-sitosterol)，還得到了苦瓜腦甙(momorcerebroside)和大豆腦甙(soyacerebroside)這2 個(gè)酰胺類化合物以及一種生物堿尿嘧啶(uracil)。1981 年，Akhtar 等［4］研究了苦瓜對正常及含四氧嘧啶的家兔血糖的影響，推測苦瓜內(nèi)降糖活性物質(zhì)包括一種生物堿和一種類似胰島素的化合物。

關(guān)于生物堿的測定方法，已報(bào)道的有酸性染料比色法［5－6］、酸堿滴定法［7］、高效液相色譜法等［8］。各種方法既有其優(yōu)缺點(diǎn)，也有局限性。如酸性染料比色法需要對照品，每一步操作均需要氯仿萃取，樣品處理復(fù)雜，誤差較大;酸堿滴定法滴定終點(diǎn)難以控制，誤差較大;高效液相色譜法需要標(biāo)準(zhǔn)品、價(jià)格昂貴，且只能給出特定物質(zhì)的含量，操作也較繁瑣。本文利用苦瓜生物堿的堿性，探討利用電位滴定法測定苦瓜中總生物堿含量的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與試劑

苦瓜(干)，購于超市;奎寧(對照品)，上海純優(yōu)生物科技有限公司;乙醇、濃氨水、石油醚、三氯甲烷、氫氧化鈉、濃硫酸、鄰苯二甲酸氫鉀等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電位滴定儀，PHS-3C (上海佑科儀器儀表有限公司);HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠);高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

苦瓜干經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩，得到苦瓜干粉，用20 倍石油醚萃取3 次，每次12h。去除油脂和脂溶性色素后，干燥備用。

1.3.2 溶液制備

NaOH 和H2SO4溶液的配制與標(biāo)定［9］:稱取1.664 2 g 固體NaOH 于燒杯中，加水?dāng)嚢柚寥芙庖朴谌萘科恐?，用蒸餾水沖洗燒杯內(nèi)壁數(shù)次，洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容至1 000 mL。準(zhǔn)確稱取0.4 ～0.5g 鄰苯二甲酸氫鉀3 份，分別于250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 水使之溶解。再加酚酞指示劑2 滴，用待標(biāo)定的NaOH 溶液滴定至溶液呈微紅色，30 s 不褪色即為重點(diǎn)。記錄所用NaOH 體積，最終得NaOH平均濃度為0.043 mol/L。H2SO4溶液的配制與標(biāo)定:用量筒量取濃H2SO41 mL，注入1 000 mL 的容量瓶中，加水定容至1 000 mL。準(zhǔn)確量取10 mL 配好的H2SO4溶液3 份，分別于250 mL 錐形瓶中，用已標(biāo)定的NaOH 溶液滴定至溶液呈微紅色，30 s 不褪色即為重點(diǎn)。記錄所用NaOH 體積，最終得H2SO4平均濃度為0.019 mol/L。

1.3.3 苦瓜生物堿的提取

本實(shí)驗(yàn)選用4 種提取方法。

(1)酸水提取法:稱取樣品1 g，用50 mL 的1%的HCl 浸提(溫度為70℃)2 h，提取3 次，抽濾取濾液，用濃氨水調(diào)節(jié)pH 至中性，然后用等體積的氯仿萃取3 次，合并濾液。蒸發(fā)去除溶劑，得到樣品1#。

(2)乙醇回流法:稱取樣品1 g，加入50 mL 乙醇，回流提取2 h，提取3 次，抽濾，合并濾液，揮干，得到樣品2#。

(3)超聲波輔助提取法:稱取樣品1 g，加入50 mL 的70%乙醇，超聲波輔助提取1 h，提取3 次，抽濾取濾液合并，去除溶劑，得到樣品3#。

(4)堿浸泡提取法:稱取樣品1 g，用濃氨水浸潤，過夜。分別用50 mL 超聲波輔助提取3 次，抽濾取濾液，去除溶劑，得樣品4#。

1.3.4 電位滴定測定生物堿

將1.3.3 中的4 種供試液置入250 mL 三角瓶中，揮干溶劑，加入1.3.2 標(biāo)定好的硫酸溶液20 mL，超聲處理使其完全溶解。將復(fù)合電極插入溶液中，選擇mv 模式，開啟攪拌器，開始滴定，并記錄氫氧化鈉消耗的體積和對應(yīng)的電動勢，直到最終的電動勢趨于平緩，停止滴定。以空白試驗(yàn)校正。采用ORIGIN 軟件繪制一階導(dǎo)數(shù)曲線△E/△V—V，一階導(dǎo)數(shù)曲線最高點(diǎn)對應(yīng)的體積即為滴定終點(diǎn)體積［10］。

1.3.5 生物堿含量計(jì)算

苦瓜生物堿的含量(mg/g)計(jì)算以奎寧(分子質(zhì)量324)為基準(zhǔn)，按照下式計(jì)算［11］:

2 結(jié)果與討論

2.1 電位滴定

按照1.3.4 的滴定結(jié)果對消耗的NaOH 體積和電動勢作圖(以4#樣品中的其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)為例)，再對電動勢求一階導(dǎo)數(shù)，一階導(dǎo)數(shù)對體積作圖，峰尖所對應(yīng)的值即為滴定終點(diǎn)。電位滴定如圖1。

圖1 電位滴定圖(4#)Fig.1 E V graph of the potentiometric titration

2.2 幾種方法提取的樣品中生物堿的含量

按照1.3.4 下的方法測得幾種提取方法得到的生物堿含量見表1。

表1 不同提取方法得到的苦瓜中生物堿含量Table 1 Alkaloids Contents of the Momordica charantia L with different extraction methods

由表1 看出，4 種提取方法中，堿浸法提取苦瓜生物堿的得率最高，其次是超聲波輔助提取，乙醇回流法苦瓜生物堿得率最低。

2.3 精密度試驗(yàn)

取同批供試品，精密稱定6 份，用堿液浸泡提取生物堿，按照1.3.4 方法操作，分別測定供試品中總生物堿，測定結(jié)果的R S D 為0.23%，表明該方法穩(wěn)定。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取供試品5g，按照4#樣品制備方法提取，提取液分為6 等份，加硫酸完全溶解，分別于0、1、2、3、4、5 h 按1.3.4 方法滴定，NaOH 消耗體積數(shù)的RSD為0 .37%，實(shí)驗(yàn)表明該方法在5 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批苦瓜試樣6 份，精密稱定，按4#樣品制備方法提取供試品并按1.3.4 項(xiàng)下方法測定，測得苦瓜中總生物堿的含量測定結(jié)果RSD 為5.3%，表明該測定方法具有良好的重復(fù)性，符合含量測定的要求。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取已知生物堿含量的樣品(4#)5 份，分別加入奎寧對照品，按照1.3.4 的方法滴定、1.3.5 的方法計(jì)算，求得加標(biāo)回收率為90.8%，RSD 為4.30%。結(jié)果見表2。

編號 已知樣品量/mg加入對照溶液所含生物堿量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1 3.24 1.814 4.536 89.8 90.8 4.30 2 3.24 1.814 4.860 96.2 3 3.24 1.814 4.324 85.6 4 3.24 1.814 4.536 89.8 5 3.24 1.814 4.676 92.5

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明了此種方法測定苦瓜生物堿的含量具有良好的重現(xiàn)性。

3 討論

采用強(qiáng)堿滴定強(qiáng)酸，以過量的強(qiáng)酸來中和有機(jī)弱堿，以電動勢突躍判定滴定終點(diǎn)，根據(jù)求一階導(dǎo)數(shù)精確求出滴定終點(diǎn)，這種方法實(shí)現(xiàn)了對苦瓜總生物堿的定量，試驗(yàn)表明這種方法簡便靈敏且穩(wěn)定可靠。對幾種生物堿提取方法進(jìn)行對比結(jié)果顯示，堿液浸泡法生物堿得率最高，說明苦瓜中的生物堿大多以大多數(shù)生物堿是以鹽的形式存在于植物中，用氨水浸潤后使其轉(zhuǎn)為游離態(tài)。由于游離態(tài)生物堿多不溶于水而溶于有機(jī)試劑，因此苦瓜生物堿的提取可以通過先堿化再用有機(jī)試劑提取的方法。

作者曾經(jīng)研究過用酸性染料比色法［12］和酸堿滴定法［13］(溴甲酚綠和甲基紅作指示劑)測定生物堿的含量。酸性染料比色法試驗(yàn)中每一步操作均需要氯仿萃取，利用氯仿相顏色的深淺來定量樣品中生物堿的含量，操作較繁瑣，且需要對照品來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。用指示劑指示終點(diǎn)的酸堿滴定法終點(diǎn)不明顯，主觀性強(qiáng)，數(shù)據(jù)及不穩(wěn)定。本試驗(yàn)采用電位滴定法在一定程度上解決了苦瓜中總生物堿不易有效定量的難題，但由于該方法是基于奎寧(苦瓜中存在的一種生物堿)作為基準(zhǔn)來定量苦瓜中的總生物堿，離精準(zhǔn)定量尚有一定距離，因此再對苦瓜中生物堿類進(jìn)行進(jìn)一步分離、含量測定后重新選取基準(zhǔn)物質(zhì)，來對這種測定方法加以完善，更好地對苦瓜進(jìn)行質(zhì)量控制。

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