高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中6 種農(nóng)藥的殘留量

馮永巍，薛慶海，汪振炯

1(無(wú)錫市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 無(wú)錫，214101)

2(南京曉莊學(xué)院 生物化工和環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京，211171)

目前，我國(guó)在茶葉生產(chǎn)過(guò)程中濫用、超量使用農(nóng)藥的行為比較普遍，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)茶葉的農(nóng)藥殘留的狀況令人擔(dān)憂(yōu)［1－3］。2012 年初，“國(guó)際綠色和平組織“發(fā)布了《2012 年茶葉農(nóng)藥調(diào)查報(bào)道》，曝光了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上茶葉產(chǎn)品中噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、樂(lè)果、多菌靈等多種農(nóng)藥的殘留情況。在我國(guó)現(xiàn)行的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，上述農(nóng)藥大多沒(méi)有規(guī)定其在茶葉中的最大殘留量，少數(shù)農(nóng)藥如噻嗪酮雖然規(guī)定了最大殘留的限量值10 mg/kg［4］，卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)0.05 mg/kg［5］。為了保護(hù)消費(fèi)者的身體健康，加強(qiáng)對(duì)上述農(nóng)藥殘留的跟蹤檢測(cè)并在國(guó)標(biāo)中規(guī)定合理的殘留限量指標(biāo)顯得十分迫切和必要。

國(guó)內(nèi)對(duì)茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)主要應(yīng)用氣相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法等。這些方法不同程度的存在檢測(cè)靈敏度低，前處理過(guò)程繁冗、復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等缺點(diǎn)。高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)具有高通量、高靈敏度，能夠獲得精確質(zhì)量數(shù)和同位素信息等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)殘檢測(cè)中有著非常良好的應(yīng)用前景［6－8］。2003 年美國(guó)農(nóng)業(yè)部提出QuEChERS 樣品處理技術(shù)［9］，水果、蔬菜均質(zhì)后的樣品經(jīng)乙腈(或酸化乙腈)提取，采用萃取鹽鹽析分層后，利用基質(zhì)分散萃取機(jī)理，采用PSA(N-丙基乙二胺)或其他吸附劑與基質(zhì)中絕大部分干擾物(有機(jī)酸、脂肪酸、碳水化合物等)結(jié)合，通過(guò)離心方式去除，從而達(dá)到凈化的目的。在保留高回收率的前提下，極大的提高了樣品前處理的效率。本研究以?xún)?yōu)化的QuEChERS 方法作為前處理方法，建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)茶葉產(chǎn)品中噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、樂(lè)果、多菌靈等殘留的高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)方法，為茶葉中農(nóng)藥多殘留篩查提供了一種新的技術(shù)選擇。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫6530 高效液相色譜串聯(lián)型四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀;MassHunter 工作站及定性軟件;CT15RT型離心機(jī);Milli-Q Academic 型超純水機(jī)。噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、樂(lè)果、多菌靈等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所;乙腈、甲酸均為色譜純;乙酸、硫酸鎂化學(xué)試劑均為化學(xué)純;PSA、GCB 購(gòu)于上海安普科學(xué)儀器有限公司;茶葉樣品均購(gòu)自當(dāng)?shù)赜袡C(jī)茶場(chǎng)。

1.2 儀器工作條件

色譜柱(STABLE BOND-C18 150 mm ×2.1 mm，1.8 μm);流動(dòng)相:1%甲酸/水，B:1%甲酸/乙腈;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0 ～12 min，10% ～98%B、12 ～20 min，98% ～10%B;色譜柱溫度:45℃;進(jìn)樣量:5 μL。

ESI 源;正離子模式;噴嘴電壓500 V;干燥氣溫度和流速:300℃、6 L/min;霧化氣壓力:40Pa;鞘氣溫度325℃，鞘氣流量10 L/min;毛細(xì)管電壓:4 000 V;質(zhì)譜采集范圍為m/z 100 ～500。碎裂電壓:100 V。

1.3 樣品前處理

取茶葉樣品30 g 均質(zhì)粉碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎的茶葉粉末10 g 于50 mL 離心管中，加入10 mL 的乙酸/乙腈溶液(體積比1∶100)，劇烈震蕩提取1 min，于4 000 r/min 離心10 min。取上清液5 mL，加入到含有150 mg PSA 和45 mg GCB 的15 mL 離心管中，劇烈震蕩1 min，于4 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.4 檢測(cè)限

將系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加到樣品中，按上述方法提取、進(jìn)樣分析。以信噪比3∶1 作為檢測(cè)限(LOD)。

1.5 回收率與精密度

在空白樣品中分別添加10、20、50 μg/kg 標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度6 個(gè)重復(fù)，取平均值計(jì)算回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性檢測(cè)

2.1.1 精確分子量測(cè)定

茶葉中6 種農(nóng)藥殘留的色譜分離和定性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 中所列6 種農(nóng)藥的保留時(shí)間來(lái)看，在色譜分離過(guò)程中多種農(nóng)藥實(shí)現(xiàn)了基線(xiàn)分離。保留時(shí)間是分析物定性確證的重要信息，同時(shí)通過(guò)色譜分離也最大限度的排除了“共流物”中質(zhì)量相近物質(zhì)對(duì)分析的干擾。試驗(yàn)中采用正離子模式電離獲得了理想的響應(yīng)值，被檢測(cè)分子經(jīng)電離后獲得一個(gè)正電荷，形成［M+1］+分子離子。將表1 中所列6 種農(nóng)藥的理論分子量和測(cè)量分子量進(jìn)行比較，6 種農(nóng)藥檢測(cè)質(zhì)量偏差均小于5.0 mDa，說(shuō)明檢測(cè)分子量的準(zhǔn)確度較高，精確分子量數(shù)可以作為被測(cè)物質(zhì)定性鑒別的依據(jù)。以農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉為例，以［M +1］+作為提取離子，從總離子流中提取色譜圖(圖1)。從圖1 中可以看出，在背景復(fù)雜的總離子圖中提取吡蟲(chóng)啉的［M +1］+離子的質(zhì)荷比為256.061 9，質(zhì)量差設(shè)置為2.5mDa，得到了提取色譜圖，在保留時(shí)間7.727 min處的色譜峰峰型良好，并且沒(méi)有其他雜質(zhì)干擾，以峰面積積分可進(jìn)行進(jìn)一步的定量分析。

表1 6 種農(nóng)藥的飛行時(shí)間質(zhì)譜定性檢測(cè)結(jié)果Table 1 The qualitative detection results of six pesticides by HPLC-TOF MS

圖1 吡蟲(chóng)啉的總離子流色譜圖和提取離子流色譜圖Fig.1 The total ions chromatogram (TIC)and extraction ions chromatogram(EIC)

2.1.2 同位素測(cè)定

飛行時(shí)間質(zhì)譜除了能提供被測(cè)物質(zhì)的精確質(zhì)量數(shù)之外還能提供被檢測(cè)物的同位素信息，大多數(shù)的農(nóng)藥分子中都含有N、S、P、Cl、Br 等元素，這些元素與其特定的“A+1”或“A +2”同位素的豐度比值是一個(gè)常數(shù)，因此特征同位素比例也能夠?yàn)檗r(nóng)藥殘留的定性確證提供有力的依據(jù)。圖2 是農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉的質(zhì)譜圖，在質(zhì)譜圖中可以看到m/z = 256.061 9 和258.069 6的2 個(gè)峰，兩峰的質(zhì)荷比約相差2，豐度比為3∶1，符合37Cl 和39Cl 的同位素比例規(guī)律，可以推斷該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式中含有1 個(gè)Cl－，此推斷與吡蟲(chóng)啉(C10H12N4Cl)的元素組成相吻合。圖3 是毒死蜱(C9H11Cl3NO3PS)的質(zhì)譜圖，在圖2 中可以看到m/z為349.935 6 和351.933 1 兩個(gè)峰，2 個(gè)峰的質(zhì)荷比約相差2，豐度比為1∶1，推斷該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中可能含有3 個(gè)Cl－離子，該推斷與毒死蜱的分子組成相符合?？梢?jiàn)同位素信息在農(nóng)藥殘留的定性分析上非常有價(jià)值。飛行時(shí)間質(zhì)譜與其他濾過(guò)型質(zhì)譜不同，它采用的全掃描模式可以記錄檢測(cè)中的所有信號(hào)，這也為農(nóng)藥的非靶向目標(biāo)物的檢測(cè)提供了一種可能，通過(guò)數(shù)據(jù)采集軟件把滿(mǎn)足一定條件的色譜峰從總的離子流中提取出來(lái)，再考察色譜峰的質(zhì)譜圖里是否含有特征同位素信息，減小非靶向目標(biāo)物篩查范圍，從而實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留非靶向篩查。在新型農(nóng)藥不斷涌現(xiàn)，濫用農(nóng)藥行為越來(lái)越隱蔽的今天，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行非靶向篩查，將成為未來(lái)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重要手段。

圖2 吡蟲(chóng)啉的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrogram of imidacloprid

圖3 毒死蜱的質(zhì)譜圖Fig 3. the mass spectrogram of chlorpyrifos

2.3 定量檢測(cè)

茶葉樣本中的基質(zhì)比較復(fù)雜，除了糖類(lèi)、氨基酸、咖啡因還有大量的酚類(lèi)物質(zhì)和色素類(lèi)物質(zhì)，基質(zhì)的存在一方面導(dǎo)致比較高的背景，另一方面在雜質(zhì)再電離過(guò)程中與檢測(cè)目標(biāo)物爭(zhēng)奪電荷，導(dǎo)致信噪比的降低，從而影響定量檢測(cè)準(zhǔn)確性。因此，在充分提取的基礎(chǔ)上對(duì)樣品進(jìn)行凈化對(duì)于飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中十分重要。本研究在經(jīng)典的QuEChERS 方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，由于茶葉樣品本身的含水率較低，試驗(yàn)中省略了MgSO4除水的過(guò)程，直接采用酸化乙腈對(duì)茶葉樣品中的農(nóng)藥進(jìn)行提取。根據(jù)茶葉中的特定基質(zhì)，試驗(yàn)選擇PSA 作為吸附劑吸附茶葉中的有機(jī)酸、酚類(lèi)和脂肪酸，選擇高比例的GCB(石墨化碳黑)吸附葉綠素和其他非極性的干擾物，對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理。茶葉樣品中6 種農(nóng)藥殘留的定量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2 中顯示，6 種農(nóng)藥的檢測(cè)限不盡相同，其中噻嗪酮的檢測(cè)限最低為0.01 μg/kg，毒死蜱的檢測(cè)限最高為1 μg/kg。6 種農(nóng)藥在1 ～50 μg/kg 濃度范圍內(nèi)，均線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.995 ～0.999之間;在10、20、50 μg/kg 3 個(gè)濃度下的加標(biāo)回收率在80% ～102%之間;平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)在4% ～6%之間。

表2 六種農(nóng)藥的定量檢測(cè)結(jié)果Table2 The qualitative detection results of six pesticides by HPLC-TOF MS

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)檢測(cè)茶葉中噻嗪酮、毒死蜱、啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、樂(lè)果、多菌靈等6 種農(nóng)藥殘留量的高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜方法。本法采用優(yōu)化的QuEChERS 前處理步驟，操作簡(jiǎn)便、快捷，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，能滿(mǎn)足茶葉中多種農(nóng)藥殘留的定性、定量檢測(cè)。

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