鐮刀菌對(duì)麥汁濁度的影響*

彭曉斌，劉春鳳，李永仙，李崎

(江南大學(xué)教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

鐮刀菌屬于真菌中的半知菌類(lèi)，由于該屬的大型分生孢子多呈鐮刀狀而得名，是大麥赤霉病的主要病原菌，在溫度為16 ～24℃，相對(duì)濕度為85% ～90%時(shí)，會(huì)產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素［1］，諸如:嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素等，對(duì)人和動(dòng)物造成危害。其中嘔吐毒素含量較高，對(duì)啤酒釀造原料的影響最大，在濕熱的條件下由鐮刀菌于農(nóng)作物在田間生長(zhǎng)過(guò)程和制麥過(guò)程中產(chǎn)生［2］。嘔吐毒素的存在不僅對(duì)公眾健康造成危害［3－5］，同時(shí)也會(huì)對(duì)麥芽的品質(zhì)造成影響，故不同國(guó)家與地區(qū)對(duì)食品中嘔吐毒素含量均有限量標(biāo)準(zhǔn)［6－7］。麥芽中的嘔吐毒素主要來(lái)自2 個(gè)方面，一是用含有嘔吐毒素的大麥來(lái)制麥，二是大麥在制麥過(guò)程中感染了鐮刀菌而產(chǎn)生。目前大多數(shù)研究主要針對(duì)第一種情況，一旦檢出毒素超標(biāo)就停止使用，但是當(dāng)碰到大麥毒素很低，制成麥芽后毒素超標(biāo)，這時(shí)檢測(cè)出來(lái)就已經(jīng)滯后。本研究特選擇了禾谷、燕麥、串珠、雪腐［8－10］4 株鐮刀菌，接種到正常大麥上，對(duì)其在制麥過(guò)程中產(chǎn)毒素的情況進(jìn)行分析，試圖尋找染菌后麥芽的指標(biāo)變化規(guī)律，以期為釀造者提供快速預(yù)判的可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嘔吐毒素標(biāo)樣，購(gòu)自Sigma 公司，純度≥99%;甲醇，色譜純;其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

4 株鐮刀菌，購(gòu)于中科院北京微生物研究所，主要情況見(jiàn)表1，制麥用大麥:蘇啤3 號(hào)，江蘇(2009，江蘇農(nóng)墾麥芽廠)。

表1 4 株鐮刀菌詳細(xì)情況Table 1 The detailed information of 4 Fusarium spp.

Waters 液相色譜儀器，Waters 公司;IKA RV-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)東南科儀Brookfield;UV-2000 型紫外分光光度計(jì)，上海Unico 公司;SIGRIST 實(shí)驗(yàn)室啤酒濁度計(jì)，美國(guó)南行儀器有限公司;2300 Kjeltec 型凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS 公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 麥芽中嘔吐毒素色譜分析

稱(chēng)取20 g 麥芽樣品，粉碎至20 目大小，轉(zhuǎn)移到250 mL 具塞三角瓶中，加入8 mL 水和100 mL 萃取劑(氯仿與無(wú)水乙醇體積比為4∶1)，放置200 r/min搖床上1 h，過(guò)濾取50 mL 濾液，于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，再分別用50 mL 石油醚與30 mL 80%甲醇水溶液洗滌倒入250 mL 分液漏斗，搖勻靜置分層后，取下層液體，再于55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，20%甲醇水溶液定容至2 mL，過(guò)0.45 μm 濾膜處理。采用色譜柱Zorbax Eclipose XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)［11］，流動(dòng)相為甲醇－0.05%磷酸水溶液(20 ∶80，v/v)，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。樣品與嘔吐毒素標(biāo)樣分離的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

1.2.2 常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)方法［12－15］

α-氨基氮，β-葡聚糖，木聚糖，考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白質(zhì)濃度，總多酚，麥芽總蛋白質(zhì)與庫(kù)值，均采用分光光度法。

圖1 染菌麥芽樣品與嘔吐毒素標(biāo)樣的色譜圖Fig.1 The HPLC of infected malt and deoxynivalenol standard

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鐮刀菌的培養(yǎng)與孢子的收集與計(jì)數(shù)［16］

將購(gòu)買(mǎi)的4 株鐮刀菌孢子接種到PDA 液體搖瓶中，于28℃180 r/min 搖床中培養(yǎng)3 ～5 d。待搖瓶中長(zhǎng)出較多菌絲，將其分別接種到PDA 平板上，繼續(xù)于28℃下培養(yǎng)4 d，然后用牙簽點(diǎn)種至PDA 培養(yǎng)基上，等平板上孢子數(shù)較多時(shí)，用無(wú)菌水沖洗平板，收集孢子懸液，離心(2 000 ×g，8 min)，取離心管底物物質(zhì)，用無(wú)菌生理鹽水振蕩重懸，計(jì)數(shù)。

1.3.2 制麥工藝［16］

浸麥(29 h):浸6 斷9 浸4 斷6 浸4;15 ℃;斷水時(shí)濕度控制在90%。

發(fā)芽(120 h):18 ℃24 h，15 ℃24 h，13 ℃48 h，16℃24 h;濕度控制在90 %。

焙燥(22 h):45 ℃5 h，50 ℃6 h，60 ℃6 h，70℃2 h，83 ℃3 h。

1.3.3 接種方式［16］

在第 1 次浸麥過(guò)程中分別接種禾谷(F.graminearum)、雪腐(F.nivale)、串珠(F． moniliforme)、燕麥(F.avenaceum)4 株鐮刀菌的孢子懸浮液，制麥所用大麥為400 g(水分12.75%)，按照孢子數(shù)102、103、104/g 絕干大麥的梯度分別接種，空白為未接種孢子。選擇在浸麥后取1 次樣，發(fā)芽過(guò)程中每隔1天取1 次樣，焙燥后取1 次樣，制麥時(shí)間共7d，每天取樣1 次，因此每株菌每個(gè)接種梯度下取7 次樣。

1.3.4 麥汁制備與麥芽理化性質(zhì)分析［18］

采用協(xié)定糖化法對(duì)麥芽指標(biāo)分析，對(duì)染菌麥芽的比重、浸出物濃度、千粒重、糖化時(shí)間、濾速速度、麥汁濁度進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.3.5 麥汁濁度測(cè)定

取過(guò)濾好的麥汁100 mL 放置到雙角度濁度儀，讀數(shù)即可。

2 結(jié)果與討論

2.1 制麥過(guò)程4 株鐮刀菌產(chǎn)嘔吐毒素情況

圖2 ～圖5 分別為禾谷(F.graminearum)、燕麥(F.avenaceum)、串 珠 (F.moniliforme)、雪 腐(F.nivale)4 株鐮刀菌在制麥過(guò)程中產(chǎn)嘔吐毒素具體情況。浸麥過(guò)程(第1 天)中由于經(jīng)過(guò)水的洗滌，所以菌含量很少，毒素基本檢測(cè)不到，隨后發(fā)芽前期孢子萌發(fā)，鐮刀菌產(chǎn)生的毒素依舊很少，發(fā)芽后期(第4天和第5 天)由于菌量增加，毒素含量急劇增加，最高可以達(dá)到1.5 mg/kg，而烘焙過(guò)程中毒素含量變化不大。接種量為104孢子數(shù)/g 絕干大麥時(shí)，染禾谷、燕麥、串珠、雪腐鐮刀菌的麥芽毒素分別為1.55，1.31，1.26，1.19 mg/kg，超出了目前國(guó)家安全法規(guī)中對(duì)谷物的定量限度［7］，所以鐮刀菌對(duì)于釀造安全是存在潛在危害的。未接種鐮刀菌的大麥在制麥過(guò)程中毒素從0 增加到0.4 mg/kg，空白里面毒素增加，有可能是制麥大麥中存在鐮刀菌，其在發(fā)芽的濕熱條件下也產(chǎn)生了毒素。

圖2 制麥過(guò)程中禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒素情況Fig.2 Deoxynivalenol content producted by F. graminearum during malting

圖3 制麥過(guò)程中燕麥鐮刀菌產(chǎn)毒素情況Fig.3 Deoxynivalenol content producted by F. avenaceum during malting

2.2 染菌麥芽相關(guān)理化指標(biāo)分析

對(duì)染菌麥芽的相關(guān)理化指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。染菌麥芽與未接種鐮刀菌的麥芽千粒重、糖化時(shí)間差別不大，過(guò)濾速度有所加快，浸出物含量有所增加。而染菌麥芽麥汁的濁度明顯增大，染菌麥芽濁度為空白的2 ～2.7 倍。對(duì)于接種同一株鐮刀菌的麥芽來(lái)說(shuō)，麥汁濁度和接種量成正相關(guān)，可能是鐮刀菌的接入導(dǎo)致了麥汁濁度的增大。

表2 不同鐮刀菌接種梯度下的染菌麥芽的指標(biāo)分析表Table 2 Analysis of malts infected by Fusarium with different inoculum concentration

圖4 制麥過(guò)程中串珠鐮刀菌產(chǎn)毒素情況Fig.4 Deoxynivalenol content producted by F.moniliforme during malting

圖5 制麥過(guò)程中雪腐鐮刀菌產(chǎn)毒素情況Fig.5 Deoxynivalenol content producted by F.nivale during malting

2.3 染菌麥芽與濁度相關(guān)理化指標(biāo)分析

為研究染菌麥芽協(xié)定麥汁濁度異常的問(wèn)題，本研究對(duì)染菌麥芽的相關(guān)理化指標(biāo)進(jìn)行了分析檢測(cè)(見(jiàn)表3)，檢測(cè)方法見(jiàn)本文材料與方法1.2.2。

從表3 可以看出，接種4 株鐮刀菌的麥芽協(xié)定麥汁濁度都有不同程度的增加，空白麥汁濁度為2.04EBC，實(shí)驗(yàn)組的濁度在2.45 ～5.58EBC。接種量為104孢子數(shù)/g 絕干大麥時(shí)，染禾谷、燕麥、串珠、雪腐鐮刀菌的麥芽麥汁的濁度分別為5.58、4.96、4.75、4.07 EBC。以禾谷為例，染菌麥芽的蛋白質(zhì)與麥汁多酚與空白相比分別增加了20.2 mg/g 和37.0 mg/L，而β-葡聚糖與可溶性木聚糖含量則恰好相反，分別降低了73.11 和65.74 mg/L。麥汁中的濁度主要是由非淀粉質(zhì)多聚糖顆粒(木聚糖和葡聚糖)，蛋白質(zhì)顆粒，多酚-蛋白質(zhì)凝聚物顆粒含量或皮殼碎片與未溶解的胚乳細(xì)胞顆粒造成的，而多酚與蛋白質(zhì)之間通過(guò)脯氨酸鍵合在一起，慢慢形成晶核，從而導(dǎo)致濁度增加［17－18］。根據(jù)本研究的測(cè)定數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)麥芽中多酚與蛋白質(zhì)含量增加，故認(rèn)為染菌麥芽麥汁濁度增大主要是由于蛋白質(zhì)與多酚增加引起的。β-葡聚糖和可溶性木聚糖含量有所降低，可能由于鐮刀菌在制麥過(guò)程中產(chǎn)生了β-葡聚糖酶與木聚糖酶等。

2.4 蛋白質(zhì)含量與濁度大小相關(guān)模型的建立與分析

從表3 可以看出，蛋白質(zhì)含量與濁度大小之間有明顯的線(xiàn)性關(guān)系，作蛋白質(zhì)與濁度關(guān)系的散點(diǎn)圖(見(jiàn)圖6)

表3 染菌麥芽與濁度相關(guān)理化指標(biāo)一覽表Table 3 The form of infected malt physicochemical index related to wort turbidity

圖6 蛋白質(zhì)含量與濁度的散點(diǎn)圖Fig.6 The scatter diagram of protein and turbidity

經(jīng)spss17.0 軟件分析蛋白含量、可溶性木聚糖、β-葡聚糖、多酚、α-氨基氮與濁度的相關(guān)性，其相關(guān)性分別為0.948、－0.896、－0.871、0.861、0.924，且檢驗(yàn)值P＜顯著度0.05，說(shuō)明這幾個(gè)變量與濁度具有相關(guān)性。α-氨基氮是由蛋白質(zhì)降解得到的，α-氨基氮與蛋白質(zhì)這2 個(gè)變量密切相關(guān)，用spss17.0 分析這2 個(gè)變量的偏相關(guān)性，假設(shè)其偏相關(guān)性為0，剔除α-氨基氮之后，蛋白質(zhì)與濁度的相關(guān)系數(shù)為0.012，幾乎沒(méi)有相關(guān)性，即對(duì)濁度影響的2 個(gè)變量α-氨基氮與蛋白質(zhì)，只要考慮蛋白質(zhì)這一個(gè)變量對(duì)濁度影響就可以。

通過(guò)spss17.0 軟件對(duì)蛋白質(zhì)與濁度進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸分析，獲得所擬合模型的情況簡(jiǎn)報(bào)，顯示在模型中相關(guān)系數(shù)R為0.940，而決定系數(shù)R2為0.883，校正的決定系數(shù)為0.873。擬合優(yōu)度R2，表示自變量可以解釋因變量的變化量。

對(duì)所建立回歸方程模型進(jìn)行方差分析，方差檢驗(yàn)表中F 值對(duì)應(yīng)的概率P值(0.000)＜顯著度0.05，因此應(yīng)拒絕原假設(shè)，說(shuō)明自變量和因變量之間存在顯著的線(xiàn)性關(guān)系，回歸模型成立，同時(shí)所用的回歸模型P值為0.000，因此我們用的這個(gè)回歸模型是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

建立蛋白質(zhì)(x，自變量)與濁度(y，因變量)一元線(xiàn)性模型y=ax+b，a 為0.181，b 為－18.877，且檢驗(yàn)值P(0.000)＜0.05，可見(jiàn)常數(shù)項(xiàng)a 和蛋白質(zhì)含量項(xiàng)系數(shù)b 都是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的，故模型為:濁度=0.181 ×蛋白質(zhì)含量－18.877。

經(jīng)spss17.0 分析獲得沒(méi)有進(jìn)入模型的各個(gè)變量的檢驗(yàn)結(jié)果，模型中沒(méi)有引入的3 個(gè)變量P 值分別為0.186、0.158、0.935 均大于0.05，無(wú)需再進(jìn)行分析了。分析蛋白含量、可溶性木聚糖、β-葡聚糖、多酚這幾個(gè)變量的偏相關(guān)性，剔除可溶性木聚糖、β-葡聚糖、多酚3 個(gè)變量后，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與濁度的相關(guān)性為0.779，且檢驗(yàn)值P(0.008)＜顯著度0.05，說(shuō)明在剔除其他變量影響后，蛋白質(zhì)還是與濁度有較高的相關(guān)性，故將其納入模型建立的變量中。

下面對(duì)所建立模型:濁度=0.181 ×蛋白質(zhì)含量－18.877，進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與偏差見(jiàn)表4，發(fā)現(xiàn)除第一個(gè)濁度預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間偏差稍微偏大點(diǎn)，其他預(yù)測(cè)結(jié)果基本與實(shí)測(cè)結(jié)果吻合，說(shuō)明當(dāng)麥汁中蛋白質(zhì)含量正常時(shí)，該模型的可信度不高，但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量過(guò)高時(shí)候，該模型才適用。

表4 根據(jù)蛋白質(zhì)－濁度模型獲得濁度預(yù)測(cè)值及偏差表Table 4 The turbidity predictive value and deviation according to the model of protein and turbidity

3 結(jié)論

從制麥過(guò)程中4 株鐮刀菌接入的情況來(lái)看，在發(fā)芽后期，綠麥芽中嘔吐毒素含量均急劇增加，接種量為104孢子數(shù)/g 絕干大麥時(shí)，染禾谷、燕麥、串珠、雪腐鐮刀菌的麥芽毒素分別為1.55、1.31、1.26 和1.19 mg/kg，會(huì)對(duì)啤酒釀造造成潛在的危險(xiǎn)。通過(guò)對(duì)染菌麥芽的分析，發(fā)現(xiàn)染菌麥芽的麥汁濁度大幅度增加。通過(guò)spss17.0 軟件分析麥芽的理化指標(biāo)與濁度的多元線(xiàn)性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量對(duì)濁度的影響最大，建立蛋白質(zhì)含量與濁度的相關(guān)模型:濁度=0.181 ×蛋白質(zhì)含量－18.877。對(duì)于啤酒釀造者來(lái)說(shuō)，如果發(fā)現(xiàn)麥汁濁度異常，除了對(duì)影響濁度的常規(guī)因素進(jìn)行分析之外，還需對(duì)麥芽是否感染鐮刀菌毒素是否超標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

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