固態(tài)發(fā)酵豆粕的不同生產(chǎn)工藝及其營養(yǎng)品質(zhì)比較*

魏春，劉茂鋒，宣磊，汪釗

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

飼料產(chǎn)品中，豆粕目前是最主要的蛋白質(zhì)飼料。2012 年國內(nèi)豆粕加工總量(不含進口豆粕)已達1 000 萬t 以上。為降低養(yǎng)殖成本，提高豆粕消化吸收率和使用效益已成為新的研究課題。豆粕發(fā)酵后，多種抗?fàn)I養(yǎng)因子比如脲酶、胰蛋白酶抑制因子、凝血素等大大減少，可解決普通豆粕引起的仔豬腹瀉等問題［1］;另外，不容易消化的大分子蛋白減少，小肽增加，營養(yǎng)成分全面，可部分代替高價位的動物源蛋白質(zhì)飼料［2－5］。將乳酸菌應(yīng)用在豆粕發(fā)酵中還可以進一步增加發(fā)酵豆粕的益生功能、提高豆粕的使用效益，同時由于乳酸、細(xì)菌素等抑菌成分的存在，也使發(fā)酵豆粕更容易保存，可減少抗生素等化學(xué)合成藥物的使用［6－8］。

本研究選用食品安全級的米曲霉和植物乳桿菌WZ011 (Lactobacillus plantarumWZ011)為發(fā)酵菌種，組合設(shè)計了5 種固態(tài)發(fā)酵工藝，以多種指標(biāo)評價這幾種工藝對發(fā)酵豆粕營養(yǎng)品質(zhì)的影響，以期獲得最優(yōu)的益生發(fā)酵豆粕生產(chǎn)工藝。L.plantarumWZ011 具有生產(chǎn)γ－氨基丁酸(GABA)能力。GABA 是一種新型飼料添加劑，攝取少量的GABA 即可增強動物的免疫性能和抗熱應(yīng)激性能，促進生長［9］。

1 材料與方法

1．1 菌株

植物乳桿菌WZ011(L.plantarumWZ011)［10］，由實驗室自篩所得;米曲霉(Aspergillus oryzae)，購自上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司。

1.2 主要試劑

分析純試劑:無水乙酸鈉、硼酸、三乙胺、OPA(鄰苯二甲醛)、茚三酮、谷氨酸鈉、乳酸、二甲基亞砜、無水乙醇等。豬胰蛋白酶(≥2 500 u/mg)、胃蛋白酶(1:3000)、牛血清蛋白、酪蛋白、酪氨酸等。豆粕來源于浙江鴻源有限公司。

1.3 種子培養(yǎng)基

米曲霉種子培養(yǎng)基PDA(g/L):土豆200，葡萄糖20，瓊脂粉20，pH 自然。

植物乳桿菌種子培養(yǎng)基MRS(g/L):蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，葡萄糖10，無水乙酸鈉5，檸檬酸氫二銨2，磷酸氫二鉀0.33，MnSO4·H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.02，吐溫80 1 mL，pH 6.2 ～6.4。

1.4 五種生產(chǎn)工藝介紹

工藝1:米曲霉單獨固態(tài)發(fā)酵。10 g 豆粕，1 g 麩皮，3.6%的硫酸銨，含水量51%，接種量36%孢子懸液，30℃間歇翻料培養(yǎng)36 ～48 h。

工藝2:米曲霉固態(tài)發(fā)酵后水解反應(yīng)。米曲霉固態(tài)發(fā)酵后轉(zhuǎn)入55℃高溫水浴鍋中水解10 ～14 h。

工藝3:植物乳桿菌單獨固態(tài)發(fā)酵。10 g 豆粕，1 g 麩皮，3.6% 的硫酸銨，可溶性淀粉2%，含水量60%，接種量5%，30℃封口厭氧發(fā)酵60 h。

工藝4:米曲霉好氧發(fā)酵后串聯(lián)乳酸菌厭氧發(fā)酵。米曲霉固態(tài)發(fā)酵后加入可溶性淀粉2%，含水量60%，接種植物乳桿菌5%，30℃厭氧發(fā)酵60 h。

工藝5:米曲霉好氧發(fā)酵后水解再接植物乳桿菌厭氧發(fā)酵。米曲霉固態(tài)發(fā)酵后轉(zhuǎn)入55℃高溫水浴鍋中水解10 ～14 h，再加入可溶性淀粉2%，含水量60%，接種植物乳桿菌5%，30℃封口厭氧發(fā)酵60 h。

1.5 發(fā)酵豆粕各項指標(biāo)檢測方法

干重的測定參考國標(biāo)GM 6435 －1986。乳酸的檢測采用NaOH 滴定法?？扇苄缘鞍椎臏y定參考Da Teng 等的方法［5］。溶解度(氮溶指數(shù))的測定參考AOCSBa11 －65 的方法。小肽含量測定參考GB/T 22492 －2008 大豆肽粉國標(biāo)法。游離氨基酸測定參考GB/T 8314 －2002?？偘被帷⒂坞x總氨基酸含量測定參考GB/T 14965 －1994。豆粕還原糖測定參考DNS 法［11］。中性蛋白酶測定參考國標(biāo)SBT 10317 －1999。乳酸菌活菌數(shù)測定按照稀釋涂布法稀釋一定倍數(shù)后涂布培養(yǎng)，48 h 后計單菌落。粗蛋白的測定參考凱氏定氮法(GB/T 6432 －1994)，利用自動定氮儀測定。脲酶含量以滴定法測定［12］，酶活定義為每分鐘每克大豆制品釋放氮的毫克量。胰蛋白酶抑制因子的測定參考馬文強等研究者的方法［13］。GABA以HPLC 方法檢測［10］。SDS －PAGE 和蛋白質(zhì)分析參考Da Teng 等研究者的方法［5］。體外消化試驗參考Da Teng 等人的方法，先用胃蛋白酶在酸性環(huán)境下37℃進行消化4 h 后再用胰蛋白酶在中性pH 環(huán)境下消化24 h，模擬動物體內(nèi)胃腸道消化［5］。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 米曲霉固態(tài)發(fā)酵條件及水解條件的確定

5 種工藝?yán)锷婕懊浊构虘B(tài)發(fā)酵、水解及植物乳桿菌發(fā)酵工藝，因此，先對米曲霉固態(tài)發(fā)酵和水解條件進行了研究，植物乳桿菌發(fā)酵條件參照已有研究結(jié)果［10］。以粗蛋白和中性蛋白酶酶活為指標(biāo)進行米曲霉單獨發(fā)酵生長周期的考察。圖1 結(jié)果表明，粗蛋白在0 ～36 h 增長最快，而后幾乎無增長。中性蛋白酶酶活在0 ～36 h 也增加最快，酶活達1196.4 u/g，而后酶活略微有所下降。這些說明米曲霉在0 ～36 h時間段，尤其是在12 ～36 h 生長迅速，而后增長緩慢，主要以產(chǎn)孢子為主。孢子粉塵不利于加工車間的環(huán)境，也不利于消化，因此，為減少成本和不利因素，36 h 為發(fā)酵終止點。

圖1 米曲霉固態(tài)發(fā)酵中蛋白酶酶活和粗蛋白含量的時間過程曲線Fig.1 Time course of protease activity and crude protein content in solid state fermentation by Aspergillus oryzae

發(fā)酵36 h 后可能由于營養(yǎng)或水分不足，米曲霉生長趨于停止，大分子蛋白、抗?fàn)I養(yǎng)因子可能還未消除完全。而米曲霉此時產(chǎn)中性蛋白酶酶活達1 196.4 u/g。許晶等利用堿性蛋白酶水解豆粕，獲得制備大豆肽的酶解工藝［14］，因此本實驗采用在發(fā)酵36 h 后繼續(xù)在蛋白酶最適酶解溫度55℃的環(huán)境下進行高溫水解的方法，以進一步水解蛋白質(zhì)。

圖2 發(fā)酵豆粕水解過程中可溶性蛋白和游離氨基酸含量的時間變化曲線Fig.2 Time course of soluble protein and free amino acid content during the hydrolysis of soybean meal after fermentation

由圖2 可見，繼續(xù)水解可顯著提高可溶性蛋白和游離氨基酸含量，在0 ～10 h 提高量最大，可溶性蛋白含量提高27.55%，游離氨基酸含量提高43.53%，而后提高不明顯。因此選用10 h 為水解終點。

2.2 發(fā)酵豆粕主要營養(yǎng)指標(biāo)比較和分析

2.2.1 營養(yǎng)指標(biāo)總體比較

通過各指標(biāo)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，5 種工藝中，工藝3的豆粕營養(yǎng)指標(biāo)最差，說明植物乳桿菌單獨發(fā)酵會消耗部分酸溶性蛋白和小肽。工藝2 的豆粕酸溶性蛋白、氮溶指數(shù)、小肽增加最多，分別為9.73 倍、25.1%、10.94 倍。這3 項同時表明了在米曲霉發(fā)酵后進一步水解，酸溶性蛋白、氮溶指數(shù)以及小肽具有明顯的提高，這些都明顯改善了大豆蛋白營養(yǎng)及在動物體內(nèi)的消化吸收［15－16］。水解后還原糖比水解前提高了34.92%，說明55℃水解也有助于纖維素酶、淀粉酶水解更多的多糖成還原糖，更易消化吸收。與植物乳桿菌串聯(lián)發(fā)酵后的工藝四，其大部分營養(yǎng)指標(biāo)均優(yōu)于工藝五。在植物乳桿菌活菌數(shù)和GABA 含量上，工藝4 比工藝5 分別高69.3%和352%。

表1 五種工藝對應(yīng)的發(fā)酵豆粕營養(yǎng)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of nutrition index of fermented soybean meals with five different production technology

表2 六種豆粕飼料氨基酸含量分布Table 2 Amino acid composition of six kinds of soybean meals

此植物乳桿菌在最優(yōu)條件下液態(tài)培養(yǎng)時可產(chǎn)GABA 達5.8 g/L［10］。雖然本研究中植物乳桿菌WZ011 生產(chǎn)GABA 并不在最優(yōu)條件下，工藝4 豆粕中測得的GABA 含量相對液態(tài)發(fā)酵含量較低，但說明該菌株在固態(tài)發(fā)酵中也具有產(chǎn)GABA 的能力。范志勇等人報道，在生長豬日糧中添加GABA(50、100 mg/kg)，可顯著提高生長激素、促黑激素、促甲狀腺激素(TSH)的分泌水平，對動物激素具有積極的調(diào)節(jié)作用［17］。工藝4 所得豆粕的GABA 含量達371 mg/kg，完全可以滿足豬對GABA 的少量需求，因此該飼料具有比一般乳酸菌發(fā)酵飼料更全面的促生長功效。

脲酶在國家飼料標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不得大于0.4 mg/g. min，工藝4 脲酶酶活已減少到無法檢出，同時其胰蛋白酶抑制因子消除率也最高，達91.8%。胰蛋白酶抑制因子本質(zhì)上是水溶性球蛋白［18］，因此工藝4中高的胰蛋白酶抑制因子消除率可能是植物乳桿菌發(fā)酵過程中的蛋白酶進一步降解所致。

2.2.2 游離氨基酸含量分布比較

表2 結(jié)果表明，除了工藝3 總氨基酸含量降低以外，其他類型豆粕飼料的總氨基酸含量都有所增加。其中工藝2 增加最多，達25.3%，其必需氨基酸含量也增加最多，達26.04%。必需氨基酸含量增加，說明豆粕在進一步降解的條件下，必需氨基酸比例有增加的趨勢。在各種氨基酸中，組氨酸含量增加最多，達105.5%。組氨酸對成年動物而言，是一種非必需氨基酸，但對幼齡動物卻是必需氨基酸。工藝2 中組氨酸含量的增加，對于喂養(yǎng)幼齡動物更具優(yōu)勢。賴氨酸作為豆粕飼料中第1 限制性氨基酸，顯著影響著動物的代謝和生長，其含量在工藝1、工藝2、工藝4 豆粕中較原豆粕分別增加9.3%、11.8%、7.9%。因此用于豬特別是乳豬的飼料中，工藝2 豆粕的氨基酸營養(yǎng)價值最高。

2.2.3 可溶性蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 分析

各種發(fā)酵工藝對豆粕蛋白質(zhì)分子量的影響如圖3 所示。分子量＞45 kDa 定為大分子蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量在15 ～45 kDa 定為中分子量蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量＜15 kDa 定為小分子蛋白質(zhì)。通過軟件GlyKo Band-Scan (Version 5.0)分析各條帶的濃度比例［5］，結(jié)果如表3。

圖3 各種豆粕飼料的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果圖Fig.3 SDS-PAGE diagram of the protein composition for different soybean meal feedingstuffs

表3 各種豆粕飼料中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular weight distribution of the proteins from different soybean meal feedingstuffs

圖3 和表3 表明，經(jīng)過米曲霉發(fā)酵的豆粕(Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ)，其大分子蛋白得到了有效地降解，主要的抗原蛋白β－伴球蛋白基本被消除，蛋白質(zhì)主要集中在20 kDa 以下。而只有植物乳桿菌發(fā)酵的豆粕(Ⅱ)，其蛋白質(zhì)幾乎沒有被降解。和米曲霉單獨發(fā)酵相比較，工藝2 對豆粕中球蛋白β 亞基(50 kDa 左右)的消除更徹底，表明水解10 h 比繼續(xù)發(fā)酵10 h更有利于蛋白酶參與的降解。米曲霉發(fā)酵后串聯(lián)植物乳桿菌發(fā)酵所得的豆粕蛋白(第Ⅲ組)分子量明顯比米曲霉發(fā)酵后水解再加植物乳桿菌發(fā)酵(Ⅳ組)的更低。分析原因可能是:米曲霉發(fā)酵后不經(jīng)水解步驟直接加植物乳桿菌發(fā)酵，米曲霉自溶現(xiàn)象不明顯，其蛋白酶在后續(xù)發(fā)酵過程中仍會繼續(xù)少量分泌，從而有利于降解生成更多的小分子蛋白［19］，而采用高溫水解之后的米曲霉自溶嚴(yán)重，其蛋白酶停止分泌，不再增加，同時菌體內(nèi)的一些高分子量蛋白質(zhì)釋放至培養(yǎng)基中，導(dǎo)致小分子量蛋白的比例減少。

2.3 五種工藝發(fā)酵豆粕和原豆粕的體外消化

體外消化率結(jié)果如圖4 所示，其中工藝4(米曲霉發(fā)酵后直接串聯(lián)植物乳桿菌厭氧發(fā)酵豆粕)的消化率最高，達到96.8%，高于Da Teng 等人研究的最高消化率(85.36%)［5］。結(jié)果表明，米曲霉有氧發(fā)酵后與植物乳桿菌串聯(lián)進行厭氧發(fā)酵的工藝使得豆粕中的蛋白質(zhì)更容易被消化。

圖4 六種豆粕飼料體外消化率Fig.4 In vitro digestibility of six kinds of soybean meal feedingstuffs

3 結(jié)論

(1)單菌發(fā)酵工藝結(jié)果的比較分析表明，經(jīng)米曲霉發(fā)酵后55℃水解的豆粕營養(yǎng)品質(zhì)要優(yōu)于米曲霉單獨發(fā)酵和植物乳桿菌單獨發(fā)酵，各種蛋白質(zhì)、小肽、氨基酸含量都高于無水解步驟的單菌發(fā)酵，更易于消化吸收，同時脲酶和胰蛋白酶抑制因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量更低。單菌發(fā)酵結(jié)合高溫水解有利于營養(yǎng)指標(biāo)的改善。

(2)雙菌串聯(lián)發(fā)酵工藝結(jié)果的比較分析表明，米曲霉有氧發(fā)酵36 h 后直接串聯(lián)植物乳桿菌厭氧發(fā)酵(工藝4)所獲豆粕在營養(yǎng)品質(zhì)上優(yōu)于中間加高溫水解步驟工藝(工藝5)所獲的豆粕，也優(yōu)于單菌發(fā)酵的豆粕和原豆粕。在本研究中，高溫水解在雙菌串聯(lián)發(fā)酵中并不能提高其營養(yǎng)價值。

(3)工藝4 的發(fā)酵豆粕在營養(yǎng)指標(biāo)上除了常規(guī)成分外，還含有乳酸4.95%，GABA 0.317 mg/g，植物乳桿菌活菌數(shù)1.93 ×1010CFU/g，。發(fā)酵產(chǎn)品具酸香味，體外消化率達96.8%。

該雙菌串聯(lián)固態(tài)發(fā)酵工藝簡單可行且綠色環(huán)保，所產(chǎn)豆粕的營養(yǎng)價值高、富含益生菌及益生素，可以減少抗生素和防腐劑的使用，在飼料行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)具有應(yīng)用意義。

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