低聚木糖的超濾純化生產(chǎn)工藝優(yōu)化*

章茹，曹濟(jì)，劉輝，馮斐

1(南昌大學(xué)鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室，江西 南昌，330046)

2(南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌，330031)

低聚木糖是目前國內(nèi)外頗受關(guān)注的功能性低聚糖之一［1］，其制備一般是由天然原料如秸稈、玉米芯、甘蔗渣、棉籽殼等經(jīng)預(yù)處理及酶水解后，得到富含低聚木糖的酶解液［2］。酶解液經(jīng)板框過濾后，仍含木質(zhì)素、酶蛋白、未降解的木聚糖、色素、無機(jī)鹽等雜質(zhì)［3］，純化過程主要包括除雜、脫色及脫鹽等［4］。目前低聚木糖的純化方法主要有色譜柱分離法、活性炭柱層析乙醇洗脫法［5］、酶法、酸堿法提?。?］、微生物發(fā)酵法及膜分離法等，其中色譜法設(shè)備投資高、操作復(fù)雜且成本高;酶法中氧化酶價格偏高，經(jīng)濟(jì)性較差;發(fā)酵法操作復(fù)雜且微生物選擇較為困難。超濾膜分離法具有收率高、破壞小、能耗低、設(shè)備簡單、可連續(xù)生產(chǎn)無污染等優(yōu)點，可長期連續(xù)使用并保持較恒定的產(chǎn)量和穩(wěn)定的分離效果［7］，是當(dāng)前低聚糖和多糖等分離純化研究中十分活躍的領(lǐng)域［8］。

關(guān)于超濾用于分離純化糖類的文獻(xiàn)不多。伍軍等［9］研究了不同材質(zhì)和孔徑的超濾膜對大豆黃漿水中低聚糖和乳清蛋白的分離效果，但其并未確定最佳超濾純化條件。孫瑜［10］在實驗室條件下研究了超濾法純化大黃多糖中超濾時間、溫度、壓力、pH 值等的影響。肖光耀［11］在研究大豆多肽酶解液的膜分離濃縮工藝條件中，只討論了多肽的濃縮未明確說明分離蛋白質(zhì)和糖類的效率。

本研究采用工業(yè)化超濾膜分離裝置，對秸稈酶解液中的低聚木糖進(jìn)行分離純化工藝優(yōu)化研究。以蛋白、木質(zhì)素去除率和低聚木糖的透過率為評價指標(biāo)，考察料液濃度、操作壓力、溫度、pH 值對超濾除雜的影響，通過Box-Behnken 模型優(yōu)化確定最佳超濾工藝條件并檢驗該條件下的純化效果，為秸稈酶解液中低聚木糖超濾純化的進(jìn)一步工業(yè)開發(fā)與應(yīng)用提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 主要原料與儀器

秸稈木聚糖酶解液:山東龍力生物科技股份有限公司提供，該料液經(jīng)板框過濾，固形物濃度2.25°Brix、糖類含量33.24 mg/mL、蛋白質(zhì)含量0.8730 mg/mL、木質(zhì)素含量0.2701 mg/mL。

超濾膜分離工業(yè)生產(chǎn)裝置:內(nèi)裝ZCB-4021 中空纖維超濾膜，有效膜面積2.5 m2。

1.2 實驗方法

秸稈酶解液經(jīng)過膜組件分離后，低聚木糖進(jìn)入到透過液中，蛋白質(zhì)和木質(zhì)素被截留在膜的內(nèi)側(cè)，達(dá)到分離純化的目的。檢測原液和透過液中低聚木糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素的濃度來分析超濾分離純化的效果，考察料液濃度、操作壓力、操作溫度和pH 值各單因素對低聚木糖純化效果的影響。以此為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合原理，以低聚木糖的透過率為響應(yīng)值對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

試驗水平如表1 所示。每次試驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值表示，數(shù)據(jù)處理采用Excel 和DPS7.05 統(tǒng)計軟件。

表1 Box-Behnken 設(shè)計響應(yīng)面實驗因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design response surface experiment

1． 3 分析方法

可溶性固形物含量的測定，使用阿貝折光儀法;低聚木糖的測定，苯酚-硫酸法;還原糖的測定，3，5-二硝基水楊酸法;蛋白質(zhì)含量的測定，考馬斯亮藍(lán)法;木質(zhì)素的測定，硫酸沉淀稱重法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液濃度對低聚木糖純化的影響

15℃、0.18 MPa、pH 7.0 下，考察不同料液濃度時的超濾分離效果(圖1)。隨著料液濃度增加，低聚木糖的透過率有所減小，蛋白和木質(zhì)素去除率緩慢增大。因為料液濃度越大，溶液黏度增大溶質(zhì)間的作用力增加，濃差極化現(xiàn)象越嚴(yán)重［12］，大分子蛋白和木質(zhì)素透過膜的阻力越大，導(dǎo)致其截留率增大。

圖1 不同料液濃度對蛋白質(zhì)和木質(zhì)素去除率及低聚木糖透過率的影響Fig.1 Influence of different feed concentration on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.1.2 操作壓力對低聚木糖純化的影響

控制料液濃度2.25° Brix、操作溫度15℃、pH7.0，考察不同操作壓力下的超濾分離效果(圖2)。圖2 顯示蛋白和木質(zhì)素的去除率隨操作壓力升高先增大后稍減小，低聚木糖的透過率隨操作壓力升高逐漸升高。這是因為壓力增大一定值之后，膜的壓密效應(yīng)就會明顯，膜孔變得越小，木聚糖酶分子質(zhì)量大于20 ku、木質(zhì)素分子質(zhì)量為5 ～20 ku，故其截留率增大。而由于低聚木糖分子質(zhì)量較小在500 ～1 000，所以影響很小［13］。?

圖2 不同壓力對蛋白質(zhì)和木質(zhì)素去除率及低聚木糖透過率的影響Fig.2 Influence of different operating pressure on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.1.3 操作溫度對低聚木糖純化的影響

2.25 °Brix、0.18 MPa、pH 7.0 下，考察溫度對超濾分離效果的影響(圖3)。溫度升高，蛋白和木質(zhì)素的去除率反而有所降低。這是由于溫度上升后，溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)和遷移系數(shù)都增大，相應(yīng)地，分子質(zhì)量大的蛋白和木質(zhì)素透過膜的幾率也會增大。但是低聚木糖因為分子質(zhì)量小，隨溫度升高變化不太明顯，透過率維持在90.0% ～91.0%。

圖3 不同操作溫度對蛋白質(zhì)和木質(zhì)素去除率及低聚木糖的透過率影響Fig.3 Influence of different temperature on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.1.4 pH 值對低聚木糖純化的影響

料液pH 值對蛋白質(zhì)在溶劑中的荷電性、溶解性及分子構(gòu)型都有影響。2.25°Brix、0.18MPa、25℃下，考察pH 對超濾分離效果的影響(圖4)，與肖光耀等人［11］的研究結(jié)果相符合。料液pH 值接近蛋白質(zhì)等電點時，以游離態(tài)的懸浮狀態(tài)存在，透過阻力較大，截留率較高，大分子的木質(zhì)素更多地被截留。低聚木糖的透過率以pH 5 時最小，為88.6%，中性條件下膜的透過性能最好，其值最高為89.7%。

圖4 不同pH 對蛋白質(zhì)和木質(zhì)素去除率及低聚木糖的透過率影響Fig.4 Influence of different pH on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.2 Box-Behnken 模型優(yōu)化工藝參數(shù)

2.2.1 低聚木糖超濾純化模型的建立

根據(jù)單因素實驗所得到的范圍，以Design-Expert software 8.0.6.1 為輔助軟件，選用Box-Behnken，進(jìn)行四因素三水平共29 次試驗(其中5 個中心點)的響應(yīng)面分析［14］。這29 個點分別為:零點重復(fù)試驗5 次，用以估計實驗誤差，24 個析因點分析各因素的變化。

表2 中蛋白質(zhì)和木質(zhì)素的去除率均維持在64.9% ～69.7%，蛋白質(zhì)和木質(zhì)素在原液中含量僅為3.3%，對分離效果的影響不大，故以低聚木糖的透過率為響應(yīng)值進(jìn)行最優(yōu)化，結(jié)果見表3，并得二階多項式回歸模型［15］:

Y=91.78 －0.57A+0.36B－0.033C+0.50D+0.025AB+0.050AC－0.050AD－0.18BC－0.025BD+0.025CD－0.49A2+0.014B2－0.15C2－2.47D2

表2 響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)Table 2 The results of response surface experiment

表3 回歸模型方差分析和方程系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Variance analysis and significance equation coefficient of regression model

表3 中因素B 和A2 的P 值小于0.0500，表明該2 個因素是顯著的，其他因素對試驗結(jié)果干擾小。A，D，D2因素的P值＜0.000 1，是極顯著的模型項，其因素范圍需嚴(yán)格控制。當(dāng)P值＞0.100 0 時表明該模型項是不顯著的、干擾性大，因此其他項C、AB、AC、AD、BC、BD、CD、B2、C2是不顯著項。失擬性的F值“0.63”意味著失擬性不顯著，模型響應(yīng)穩(wěn)定。模型F 值為45.76、復(fù)相關(guān)系數(shù)R2(0.986 6)＞0.900 0，說明該模型顯著、準(zhǔn)確度高，模型能很好擬合試驗數(shù)據(jù)，適用于本工藝條件的預(yù)測。

2.2.2 最佳工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化

響應(yīng)面優(yōu)化中各交互因素的等高線圖如下。組圖可評價分析任何倆因素對超濾純化秸稈木聚糖酶解液總糖透過率的影響，并從中確定最佳因素條件。

圖5 ～圖7 中相應(yīng)的彎曲曲面變化明顯，交互作用顯著，符合單因素實驗的規(guī)律。圖8 ～圖9 顯示料液濃度與操作壓力、反應(yīng)溫度與操作壓力、料液濃度與反應(yīng)溫度的響應(yīng)面接近一個平面，交互作用不顯著，與表3 中P值的判斷一致。

Box-Behnken 模型響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為:料液濃度1.97°Bx、操作壓力0.20 MPa、反應(yīng)溫度26.02℃、pH值7.20，此時的低聚木糖的透過率為92.43%。響應(yīng)軟件得出各因素對總糖透過率的影響大小依次為:料液濃度、pH 值、操作壓力、操作溫度?？紤]實際操作的因素要求，選擇料液濃度為2.24°Bx、操作壓力0.18 MPa、反應(yīng)溫度25℃、pH 值7，進(jìn)行三次平行試驗，低聚木糖的透過率分別為92.21%、91.19%、93.33%，最大偏移值為1.34%，與模型預(yù)測結(jié)果接近。

圖5 操作壓力與pH 值對低聚木糖的透過率的影響等高線Fig.5 Effects contour of operating pressure and pH on XOS transmittance

3 結(jié)論

(1)采用工業(yè)化超濾膜分離裝置，以秸稈酶解液為原料，通過探索料液濃度、操作壓力、操作溫度、pH等關(guān)鍵工藝參數(shù)對蛋白和木質(zhì)素去除率、低聚木糖的透過率的影響，得到秸稈酶解液超濾分離純化過程中各單因素的影響規(guī)律，確定工藝條件范圍為料液濃度2.00 ～2.37°Brix、操作壓力0.18 ～0.22MPa、操作溫度25 ～30℃、pH 值7。

圖6 反應(yīng)溫度與pH 值對低聚木糖的透過率的影響等高線Fig.6 Effects contour of reaction temperature and pH on XOS transmittance

圖7 料液濃度與pH 值對低聚木糖的透過率的影響等高線Fig.7 Effects contour of material liquid concentration and pH on XOS transmittance

圖8 料液濃度與操作壓力對低聚木糖的透過率的影響等高線Fig.8 Effects contour of material liquid concentrationand operating pressure on XOS transmittance

(2)利用Design-Expert software 8.0.6.1 為輔助軟件，選用Box-Behnken 模型對實驗條件進(jìn)行優(yōu)化，并且擬合二階多項式回歸模型將實驗因素和實驗結(jié)果函數(shù)化。通過對響應(yīng)面等高線分析得到因素影響的強(qiáng)弱性依次為:料液濃度、pH 值、操作壓力和操作溫度。結(jié)合實際生產(chǎn)情況得到最優(yōu)化工藝條件為料液濃度2.24°Brix、操作壓力0.18 MPa、溫度25℃、pH7，此時低聚木糖的透過率為92.1%，蛋白去除率67.9%，木質(zhì)素去除率67.8%?，F(xiàn)場實驗與模型預(yù)測值一致，模型預(yù)測正確，最佳工藝條件合理。

圖9 操作壓力與反應(yīng)溫度對低聚木糖的透過率的影響等高線Fig.9 Effects contour of operating pressure and reaction temperature on XOS transmittance

圖10 料液濃度與反應(yīng)溫度對低聚木糖的透過率的影響等高線Fig.10 Effects contour of material liquid concentrationand reaction temperature on XOS transmittance

(3)采用超濾法生產(chǎn)工藝分離純化秸稈酶解液可行。與傳統(tǒng)純化方法相比，該法操作簡單、能耗低、無二次污染，只需控制好濃度、壓力等生產(chǎn)條件即可，具有廣闊的應(yīng)用前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

［1］ 邵佩蘭，朱曉紅. 低聚木糖生產(chǎn)中影響木聚糖提取率因素的研究［J］． 寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2000，21(4):44 －46.

［2］ Moure A，Gullon P，Dominguez H，et al.Advances in the manufacture，purification and applications of xylo-oligosaccharides as food additives and nutraceuticals［J］． Process Biochem，2006，41:1 913 －1 923.

［3］ 楊瑞金，許時嬰，王 璋. 酶法生產(chǎn)低聚木糖過程中纖維素和木聚糖-木質(zhì)素復(fù)合物結(jié)構(gòu)的變化［J］． 中國糧油學(xué)報，2001，16(6):43 －46.

［4］ 李 敏，李堅斌，梁欣泉，等. 甘蔗葉低聚糖木糖的分離純化［J］． 食品科技，2012，37(4).241 －248.

［5］ 馮 昕，陶 靜，王吉中，等. 麥麩低聚木糖產(chǎn)品的分離純化及定性分析［J］． 食品工業(yè)，2012，33(8)，80 －83.

［6］ 許正宏，熊筱晶，陶文沂. 低聚木糖的生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］． 食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，28(1)，56 －59.

［7］ 何江川，韓永萍. 超濾膜分離法在多糖分離提取中的應(yīng)用［J］． 食用菌，2005(1):5 －7.

［8］ Jacobsen S E，Wyman C E.Xylose monomer and olgomer vields for uncatalyzed hydrolysis of sugar bagasse hemicelluloses at varying solids concentration［J］． Ind Eng Chem Res，2002，41:1 454 －1 461.

［9］ 伍 軍，艾啟俊，于同泉，等. 大豆黃漿水處理過程中超濾膜的選擇［J］． 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2003，18(3):223 －225.

［10］ 孫瑜，周永傳，陳德煦. 超濾法純化大黃多糖的研究［J］． 中國中藥雜志，2009，34(2):165 －168.

［11］ 肖光耀，劉文悅，李華才，等. 大豆多肽酶解液膜分離濃縮工藝［J］． 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，46(4):625 －627.

［12］ Bian R，Yamamoto K，Watanabe Y.The effect of shear rate on controlling the concentration polarization and membrane fouling［J］． Desalination，2000.131(1-3):225 －236.

［13］ 姚瑞祺，劉海英，牛鵬飛. 不同分子量枸杞多糖的超濾分離及抗氧化活性研究［J］． 食品工業(yè)科技，2008，29(5):89 －91.

［14］ 汪志慧，孫智達(dá)，謝筆鈞. 響應(yīng)面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素［J］． 食品科學(xué)，2011，32(4):64 －68.

［15］ 孟凡冰，李云城，張淑蓉，等. 靈芝孢子多糖提取工藝優(yōu)化［J］． 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(1)，209 －213.