谷氨酸棒狀桿菌的谷氨酸分泌模式初探

姚輝，張建華，毛忠貴

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

1957 年Kinoshita 等發(fā)現(xiàn)并分離了谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，開(kāi)啟了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的新時(shí)代［1］。有研究表明，谷氨酸棒桿菌在正常生長(zhǎng)條件下不分泌谷氨酸，只有通過(guò)下面4種措施才能誘導(dǎo)谷氨酸分泌:(1)生物素亞適量［2－3］;(2)添加表面活性劑［4］;(3)添加青霉素［5］;(4)利用甘油或油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵［6－7］。雖然研究人員對(duì)于如何誘導(dǎo)谷氨酸分泌已有較清楚的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)于谷氨酸分泌的機(jī)理卻一直沒(méi)有定論。

關(guān)于谷氨酸的分泌目前有以下3 種假定模式:“泄漏”模式［2］、“載體功能逆轉(zhuǎn)”模式［8］及“特殊載體系統(tǒng)”模式［9－10］。這3 種假定模式是從細(xì)胞膜的組成、載體蛋白等方面研究谷氨酸的分泌。目前，與“泄漏”模式相關(guān)的生物素“亞適量”發(fā)酵法是生產(chǎn)谷氨酸的主要發(fā)酵方法，該方法通過(guò)生物素的濃度控制菌體的生長(zhǎng)與谷氨酸的分泌。生物素是生物細(xì)胞必需微量營(yíng)養(yǎng)因子，它的8 種同分異構(gòu)體中只有D-(+)-生物素具有生物活性，生物素主要是作為某些酶的輔酶，如乙酰-CoA 羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酰-CoA 羧化酶、β-甲基巴豆酰-CoA 羧化酶等，這些酶可以催化羧基的脫落、轉(zhuǎn)移和固定;此外生物素還參與碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)和核酸的代謝，并且還對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。

自然界中的生物素大都以游離狀態(tài)存在，但也有部分通過(guò)戊酸支鏈和蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸的ε-氨基共價(jià)結(jié)合的方式存在［11］。生物素檢測(cè)主要有微生物法、生物法、儀器分析法和親和分析法等方法［12］。微生物法檢測(cè)限較高，但特異性不強(qiáng)并且繁瑣耗時(shí);生物法只能檢測(cè)生物能夠利用的生物素;儀器分析法簡(jiǎn)單、快速，但不能區(qū)分生物素和生物素的代謝類(lèi)似物;親和分析法精確性高、檢測(cè)限低、省時(shí)，并可對(duì)復(fù)雜的樣品進(jìn)行有效分析［11］。由于谷氨酸發(fā)酵液中生物素極微量，約5 ～10 μg/L［13］，對(duì)檢測(cè)限要求極高，且會(huì)受到發(fā)酵液中蛋白質(zhì)、色素等成分的干擾，導(dǎo)致直接測(cè)定發(fā)酵液中生物素濃度的難度較大。糖蜜、玉米漿中所含生物素在發(fā)酵過(guò)程中是等量分配到每個(gè)細(xì)胞的［14］，因此作者通過(guò)控制其添加量來(lái)調(diào)節(jié)初始生物素含量，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中的菌體干重，計(jì)算單位干重菌體占有生物素的量，以此來(lái)間接表示發(fā)酵過(guò)程中生物素的濃度，稱(chēng)之為名義生物素濃度，單位是μg/g DCW。本文通過(guò)研究發(fā)酵過(guò)程中名義生物素濃度對(duì)胞內(nèi)外谷氨酸濃度變化，探討生物素對(duì)谷氨酸棒桿菌分泌谷氨酸的影響機(jī)制以及觸發(fā)谷氨酸分泌的生物素“亞適量”域值，探求其對(duì)生產(chǎn)的指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicumS9114，江南大學(xué)發(fā)酵與生態(tài)工學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏，－40℃保藏于石蠟管中。

1.1.2 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏10，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0 ～7.2。

活化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.0 ～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50，糖蜜15，玉米漿50，H3PO40.64，K2HPO43.2，MgSO40.4，pH 7.0 ～7.2。葡萄糖、糖蜜、玉米漿根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要有所變動(dòng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖160，糖蜜1.5，玉米漿6，Na2HPO41，KCl 2.2，MgSO41。

生物素測(cè)定培養(yǎng)基(g/L):分析純葡萄糖145，MgSO40.65，K2HPO41.6，KCl 0.3，F(xiàn)eSO4、MnSO4各0.002，pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物素測(cè)定方法

微生物法［15］。

1.2.2 胞內(nèi)谷氨酸測(cè)定方法

于2mL 離心管中依次加入21%高氯酸溶液300 μL，硅油500 μL(相對(duì)密度1.07;KF-54;Shin-etsu Chemical Industry Co. Ltd. ，Tokyo)，發(fā)酵液500 μL，離心(64 000 ×g，5 min，4℃)，含有菌體的高氯酸層經(jīng)超聲破碎、中和后測(cè)定胞內(nèi)的谷氨酸［16］。細(xì)胞質(zhì)容積約為1.6 μL/mg DCW［10］。

1.2.3 菌體培養(yǎng)

將一新鮮斜面洗入2L 種子培養(yǎng)基中，33℃，pH 7.0，轉(zhuǎn)速按照溶氧要求自動(dòng)調(diào)節(jié)，培養(yǎng)至葡萄糖耗盡。

1.3 檢測(cè)方法

谷氨酸、葡萄糖采用SBA-40D 生物傳感分析儀測(cè)定，吸光度采用721 可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 生物素測(cè)定

采用微生物法測(cè)定了糖蜜、玉米漿中生物素的含量，其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1，實(shí)驗(yàn)得到糖蜜和玉米漿生物素添加回收率分別為102.4%、118.7%。經(jīng)生物素添加回收率實(shí)驗(yàn)校正，糖蜜中生物素含量為2 561 ±148 μg/kg，玉米漿中生物素含量為652 ±24 μg/kg。發(fā)酵過(guò)程中的菌體干重通過(guò)繪制菌體吸光度與菌體干重標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2，從R2=0.985可以看出菌體干重和菌體吸光度有著良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 生物素濃度對(duì)C. glutamicum S9114 培養(yǎng)的影響

圖1 生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Biotin standard curve

圖2 菌體干重標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Dry cell weight standard curve

研究中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒狀桿菌在種子培養(yǎng)階段就開(kāi)始在胞內(nèi)合成谷氨酸。通過(guò)控制發(fā)酵培養(yǎng)基中糖蜜和玉米漿的添加量，使初始生物素濃度分別為20、46、69 μg/L，發(fā)酵通過(guò)流加氨水調(diào)節(jié)pH，直至葡萄糖消耗完全時(shí)結(jié)束發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)考察了初始生物素濃度對(duì)胞內(nèi)谷氨酸、胞外谷氨酸、生物素及菌體吸光度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3a、b、c 表明，菌體生長(zhǎng)與生物素密切相關(guān)，初始生物素濃度越高，菌體生長(zhǎng)越快，且最終菌體量也越高。

胞內(nèi)谷氨酸濃度變化趨勢(shì)為，在培養(yǎng)初始階段胞內(nèi)谷氨酸濃度很低，大概0 ～4 g/L。之后逐漸升高，在第12 h 左右達(dá)到最高點(diǎn)35 ～60 g/L(圖3a:60 g/L、b:49 g/L、c:35 g/L)。初始生物素濃度越高，胞內(nèi)谷氨酸濃度峰值就越低。之后胞內(nèi)谷氨酸濃度開(kāi)始逐漸下降，這是由于胞內(nèi)谷氨酸開(kāi)始向胞外分泌所致，最后胞內(nèi)谷氨酸濃度維持在某一穩(wěn)定水平20 ～40 g/L(圖3a:40 g/L、b:20 g/L、c:23 g/L)。

亞適量法谷氨酸正常發(fā)酵中，最后產(chǎn)量通常120 g/L 左右，但胞內(nèi)谷氨酸最高濃度大約在60 g/L 左右，胞外谷氨酸濃度遠(yuǎn)高于胞內(nèi)谷氨酸濃度，顯然“泄漏”模式不能解釋谷氨酸的分泌。

初始生物素水平不會(huì)影響谷氨酸開(kāi)始分泌的時(shí)間，檢測(cè)到胞外谷氨酸時(shí)胞內(nèi)谷氨酸約為32 ～47g/L(圖3a:47g/L、b:42g/L、c:32g/L)，對(duì)應(yīng)的名義生物素濃度約為2.0 ～2.29 μg/g DCW(圖3a:1.97 μg/g DCW、b:2.03 μg/g DCW、c:2.29 μg/g DCW)?？芍瑱z測(cè)到胞外谷氨酸時(shí)的對(duì)應(yīng)的名義生物素濃度集中在某一范圍內(nèi)，推測(cè)谷氨酸的分泌很可能是由生物素控制。

圖3 初始生物素濃度對(duì)C. glutamicum S9114 培養(yǎng)的影響Fig.3 The effect of initial biotin concentration on C. glutamicum S9114

2.3 生物素“名義亞適量”濃度

控制起始生物素濃度在16 ～69 μg/L，共進(jìn)行6 批次發(fā)酵試驗(yàn)，根據(jù)胞內(nèi)、胞外谷氨酸濃度變化，統(tǒng)計(jì)得到的生物素“名義亞適量”濃度如表1 所示。所以谷氨酸發(fā)酵中觸發(fā)谷氨酸分泌的“名義生物素亞適量”濃度范圍在1.97 ～2.29 μg/g DCW。

表1 不同初始生物素水平下生物素“名義亞適量”濃度Table 1 The“nominal biotin-limitation”concentration under different initial biotin concentration

2.4 添加生物素對(duì)谷氨酸分泌的影響

為了驗(yàn)證生物素在谷氨酸分泌中所起的作用，進(jìn)行了在正常發(fā)酵產(chǎn)生谷氨酸的條件下添加生物素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 添加生物素對(duì)谷氨酸分泌的影響“→”添加生物素時(shí)間Fig.4 The effect of supplement biotin on glutamic acid secretion

圖4 中，起始生物素濃度約為16 μg/L，可以看出，在0 ～8 h 的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵結(jié)果正常，胞內(nèi)谷氨酸初始濃度39 g/L，這時(shí)胞內(nèi)谷氨酸并未向外分泌，但由于谷氨酸的合成使得胞內(nèi)谷氨酸濃度略有升高，之后由于胞內(nèi)谷氨酸向胞外分泌，使胞內(nèi)谷氨酸濃度下降并維持在36 g/L 左右。在第4h 時(shí)檢測(cè)到胞外谷氨酸，此時(shí)胞內(nèi)谷氨酸濃度35 g/L，對(duì)應(yīng)的生物素濃度1.99 μg/g DCW，與2.3 中所述生物素亞適量范圍一致。在第8h時(shí)再次添加20 μg/L 生物素，使發(fā)酵液中生物素濃度由1.04 μg/g DCW 瞬間上升到2.34μg/g DCW。添加生物素后胞外谷氨酸便不再增加，一直維持在11 ～12 g/L，但胞內(nèi)谷氨酸逐漸從36g/L 上升到61 g/L，并且菌體進(jìn)入到第2 個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象再次表明，生物素是控制谷氨酸分泌的關(guān)鍵因素，當(dāng)生物素濃度在亞適量范圍內(nèi)時(shí)胞內(nèi)谷氨酸才會(huì)向胞外分泌。

3 討論

谷氨酸的分泌機(jī)理到目前為止還不是很清楚，本文研究了生物素對(duì)胞內(nèi)、胞外谷氨酸及對(duì)谷氨酸分泌等幾方面的影響，從而達(dá)到對(duì)谷氨酸分泌模式進(jìn)行初探的目的。

在2.2 不同生物素水平實(shí)驗(yàn)中，測(cè)得胞內(nèi)谷氨酸濃度范圍在0 ～60 g/L，而在正常的谷氨酸發(fā)酵后期谷氨酸濃度通常在120 g/L，胞外谷氨酸濃度遠(yuǎn)高于胞內(nèi)谷氨酸濃度，如果谷氨酸的分泌是“泄漏”模式，那么此時(shí)谷氨酸應(yīng)從胞外向胞內(nèi)泄漏，但這明顯與事實(shí)不符。所以，“泄漏”模式不能解釋谷氨酸的分泌。并且在實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到胞外谷氨酸時(shí)的名義生物素濃度集中在1.97～2.29 μg/g DCW，推測(cè)谷氨酸的分泌很可能是由生物素控制的。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)得到“名義生物素亞適量”濃度范圍在1.97～2.29 μg/g DCW，且在2.4 的實(shí)驗(yàn)中測(cè)得谷氨酸分泌時(shí)的名義生物素濃度為1.99 μg/g DCW，在“名義生物素亞適量”濃度范圍內(nèi)。之后向發(fā)酵液中添加生物素，使瞬時(shí)名義生物素濃度升高至2.34 μg/g DCW，高于“名義生物素亞適量”濃度范圍，此時(shí)谷氨酸的分泌停止。這直接證明了谷氨酸分泌受生物素濃度控制。所以本文提出谷氨酸分泌的一個(gè)新的假定模式:“生物素濃度觸發(fā)式分泌”模式，即在亞適量法谷氨酸發(fā)酵中，當(dāng)生物素豐富時(shí)，谷氨酸不向胞外分泌;而當(dāng)生物素“亞適量”時(shí)，胞內(nèi)的谷氨酸開(kāi)始向胞外分泌，如圖5。

圖5 谷氨酸分泌模式圖Fig．5 Glutamic acid secretion mode

4 結(jié)論

(1)“泄漏”模式不能解釋谷氨酸的分泌。在谷氨酸正常發(fā)酵后期胞外谷氨酸濃度通常為120 g/L，而胞內(nèi)谷氨酸濃度最高為60 g/L 左右，胞內(nèi)谷氨酸濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于胞外谷氨酸濃度，此時(shí)胞內(nèi)谷氨酸不能向外泄漏。

(2)生物素“亞適量”是觸發(fā)谷氨酸分泌的關(guān)鍵因素。本文通過(guò)生物素添加實(shí)驗(yàn)直接證明生物素的濃度可以控制谷氨酸的分泌，并測(cè)得“名義生物素亞適量”濃度范圍在1.97 ～2.29 μg/g DCW。

(3)谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物素初始含量會(huì)隨糖蜜和玉米漿來(lái)源、批次的不同出現(xiàn)波動(dòng)，進(jìn)而影響谷氨酸發(fā)酵性能和穩(wěn)定性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌生物素“名義亞適量”的范圍通常在1.97 ～2.29 μg/g DCW，并且在谷氨酸正常發(fā)酵中菌體量是穩(wěn)定在某一范圍內(nèi)。只要測(cè)定不同來(lái)源、批次的糖蜜和玉米漿中生物素的含量，然后根據(jù)發(fā)酵液中菌體量和生物素“名義亞適量”范圍，折合成初始糖蜜、玉米漿添加量，這樣可以較方便地控制谷氨酸發(fā)酵。

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