L-鳥(niǎo)氨酸-阿司匹林復(fù)合鹽結(jié)晶工藝研究

熊洋，黃志旭，朱超，張建，萬(wàn)紅貴

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京，210009)

L-鳥(niǎo)氨酸是一種非蛋白氨基酸，有很多重要的生理功能，其中最重要的作用是參與尿素循環(huán)，另外，它還能保護(hù)肝臟、刺激生長(zhǎng)激素的分泌、改善睡眠、緩解疲勞、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等［1］。近年，隨著L-鳥(niǎo)氨酸的保健及醫(yī)藥功能的逐漸被發(fā)掘，人們對(duì)它的研究及新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)逐漸產(chǎn)生了濃厚的興趣，并取得了一定的成果:含L-鳥(niǎo)氨酸的20AA 復(fù)方氨基酸制劑不僅能保護(hù)肝臟、激發(fā)病態(tài)下肝臟活力，而且與大劑量VitB6 聯(lián)合使用能有效治療多器官功能障礙引起的大出血［2］;L-鳥(niǎo)氨酸-門冬氨酸復(fù)合鹽能治療肝性腦病、肝炎以及保護(hù)肝臟［3－4］;L-鳥(niǎo)氨酸苯乙酸鹽能有效的降低鳥(niǎo)氨酸循環(huán)障礙患者體內(nèi)的血氨濃度［5－6］;鳥(niǎo)氨酸α-酮戊二酸鹽是很好的臨床營(yíng)養(yǎng)劑，能促進(jìn)外科創(chuàng)傷病人的恢復(fù)，改善慢性營(yíng)養(yǎng)不良，改善免疫功能等［7］;鳥(niǎo)氨酸檸檬酸鹽可以改善食品和飲料的口味［8］;此外，L-鳥(niǎo)氨酸與藥物形成的復(fù)合鹽能改善藥物在理化性質(zhì)上的缺陷，如鳥(niǎo)氨酸阿魏酸鹽［9］、奧扎格雷鳥(niǎo)氨酸鹽［10］等的穩(wěn)定性或水溶性較成鹽前好。研究表明，L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽不僅能改善某些藥物的穩(wěn)定性及水溶性，而且能起到聯(lián)合使用相互增強(qiáng)藥效的作用。因此，開(kāi)發(fā)L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合鹽具有很高的實(shí)用價(jià)值。

本文涉及的L-鳥(niǎo)氨酸-阿司匹林復(fù)合鹽(L-ornithine-aspirin compound salt，以下簡(jiǎn)稱“LOA”)是將L-鳥(niǎo)氨酸與阿司匹林以離子鍵結(jié)合形成的結(jié)晶產(chǎn)物，與臨床上廣泛使用的賴氨匹林相似，能有效改善阿司匹林的水溶性、穩(wěn)定性。而L-鳥(niǎo)氨酸能夠促進(jìn)血脂代謝［1，11］、保護(hù)肝臟，這將有利于LOA 用于心腦血管疾病的預(yù)防與治療，降低服用阿司匹林引起的肝毒性以及出血癥風(fēng)險(xiǎn)。目前人們對(duì)阿司匹林的精氨酸鹽以及賴氨酸鹽研究較多，生產(chǎn)工藝也比較成熟，而關(guān)于LOA 制備工藝的研究較少。而結(jié)晶過(guò)程是LOA 制備工藝中的核心所在，本研究的目的是介紹一種制備結(jié)晶型LOA 的方法，并研究了其結(jié)晶過(guò)程，重點(diǎn)探討了晶種和溶析劑流加情況對(duì)結(jié)晶質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽 實(shí)驗(yàn)室自制;阿司匹林、乙醇、氨水均為分析純?cè)噭?/p>

BT00 －300M 恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;PHS-3C pH 計(jì)，海三信儀表廠;JJ-1 精密增力電動(dòng)攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司;MasterSizer 2000激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司;leica DM 1000 顯微鏡，德國(guó)萊卡公司。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 產(chǎn)品純度測(cè)定方法

以LOA 樣品中的鳥(niǎo)氨酸含量計(jì)算產(chǎn)品的純度，其中L-鳥(niǎo)氨酸含量測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［12］。產(chǎn)品純度計(jì)算公式:

式中:ms—樣品總質(zhì)量，g;mc—樣品中實(shí)際測(cè)得的鳥(niǎo)氨酸的質(zhì)量，g。

1.2.2 阿斯匹林含量測(cè)定方法

［13］。

1.2.3 普通光學(xué)顯微鏡樣品處理方法

取少許樣品于載玻片上，滴加2 ～3 滴無(wú)水乙醇在樣品上，放在光學(xué)顯微鏡下觀察且拍照，放大倍數(shù)為64 倍。

1.2.4 粒度分布測(cè)定方法

采用MasterSizer 2000 激光粒度分析儀測(cè)定樣品粒度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽的脫鹽

將30 g 的L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽溶解在1 000 mL 水中，調(diào)節(jié)pH 到2.0，流過(guò)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換柱，L-鳥(niǎo)氨酸會(huì)與樹(shù)脂結(jié)合，而Cl－并不在樹(shù)脂上保留，而是隨著上柱液流出柱子。用300 mL 水沖洗柱子，洗去樹(shù)脂間隙中的Cl－等雜質(zhì)，再用400 mL 的濃度為2 mol/L 的氨水洗脫，濃縮除氨，得到游離的L-鳥(niǎo)氨酸水溶液。

1.3.2 LOA 粗品的制備

25℃下，取500 mL 濃度為53 g/L 的游離L-鳥(niǎo)氨酸，減壓濃縮10 倍，立即加入150 mL 無(wú)水乙醇，攪拌下，將上述L-鳥(niǎo)氨酸的乙醇溶液緩緩加入480 mL 濃度為75 g/L 的阿司匹林乙醇溶液。得到L-鳥(niǎo)氨酸-阿司匹林的白色沉淀，過(guò)濾，干燥得L-鳥(niǎo)氨酸-阿司匹林鹽粗品。

1.3.3 LOA 溶解度的測(cè)定

維持恒定溫度，溶劑配比以及攪拌速率，讓溶劑與過(guò)量的LOA 經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的混合使其趨于溶解平衡，混合液離心后取上清液，測(cè)定其中鳥(niǎo)氨酸的濃度，換算成LOA 的質(zhì)量即該條件下的溶解度。具體實(shí)驗(yàn)步驟為:配制乙醇與水的混合溶劑，將體系中乙醇的比例記為r，調(diào)整混合溶劑中乙醇與水的比例，使r值分別為:100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%;分別加入過(guò)量的LOA，攪拌，溶解平衡后，取上清液，樣品用0.25μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾液稀釋后，測(cè)定濃度。

1.3.4 LOA 的結(jié)晶

LOA 的間歇結(jié)晶過(guò)程按照溶析劑加入的量可以分成5 個(gè)階段，如圖1 所示。

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 加入結(jié)晶器，在適宜恒定的速度下攪拌;25℃下，恒流泵勻速流加乙醇，調(diào)整乙醇與LOA 溶液的體積比，添加晶種(將結(jié)晶質(zhì)量較好的LOA 樣品過(guò)標(biāo)準(zhǔn)篩，保藏備用，其中本實(shí)驗(yàn)采用125 目的晶種)，攪拌養(yǎng)晶2 h;第III、IV階段分別調(diào)整乙醇的滴加速率，使體系維持適宜的過(guò)飽和度，以適應(yīng)晶體的生長(zhǎng);當(dāng)乙醇與LOA 溶液的比例達(dá)到4∶1 時(shí)，停止流加乙醇，攪拌養(yǎng)晶，并降溫到10℃;真空抽濾，無(wú)水乙醇洗晶3 次，干燥，得到結(jié)晶樣品。

圖1 溶析結(jié)晶過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic for dilution crystallization

2 結(jié)果與討論

2.1 不同體積比的乙醇/水體系中LOA 的溶解

圖2 為25℃下不同配比的乙醇/水體系中LOA的溶解度曲線。

圖2 25℃時(shí)不同配比的乙醇/水體系中LOA 的溶解度曲線Fig.2 Solubility of LOA at different ethanol/water ratio in 25℃

在溶析結(jié)晶第I 階段，向60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液中快速流加45 mL 的乙醇，體系中乙醇的比例從0 增加到60%，此時(shí)LOA 的溶解度為523 g/L，則此時(shí)體系的過(guò)飽和度約為ΔC=77 g/L。

在溶析結(jié)晶第III 階段，繼續(xù)慢速滴加75 mL 乙醇，體系中乙醇的比例為80%，而LOA 的溶解度由523 g/L 降低到150 g/L，流加單位體積的乙醇引起的溶解度改變較大，因此為得到質(zhì)量較高的結(jié)晶產(chǎn)物，需要控制此階段乙醇的滴加速率，以維持體系的過(guò)飽和度。

在溶析結(jié)晶第IV 階段，較快速度流加120 mL 乙醇，體系中乙醇的比例為89%，LOA 的溶解度由150 g/L 降低到20 g/L。

顯然60% ＜r＜80%時(shí)，單位體積乙醇形成的過(guò)飽和度較大。從理論上分析，假設(shè)在結(jié)晶過(guò)程中晶體生長(zhǎng)速率不變，那么在第III 階段的乙醇流加速率應(yīng)該最小，以保持體系保持合理的過(guò)飽和度，避免引發(fā)爆發(fā)成核。而為了提高生產(chǎn)效率，則在第I 和第IV階段可以適當(dāng)加快乙醇流加速率。

2.2 添加晶種的優(yōu)化研究

在結(jié)晶的過(guò)程中，向體系加入少量的晶種有利于抑制一次成核并維持適量的二次成核，以提高產(chǎn)品質(zhì)量。通過(guò)控制乙醇加入量，使LOA 溶液達(dá)到一定的過(guò)飽和度，考察晶種添加時(shí)機(jī)、晶種添加量對(duì)結(jié)晶的影響。

2.2.1 晶種添加時(shí)機(jī)對(duì)結(jié)晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無(wú)水乙醇，當(dāng)V(乙醇)∶V(LOA 溶液)分別為0.6、0.8、1.0、1.2 時(shí)，加入晶種?？疾炀ХN加入時(shí)機(jī)對(duì)結(jié)晶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。

表1 晶種加入時(shí)機(jī)對(duì)結(jié)晶的影響Table 1 The influence of addition time of crystal seeds to crystal

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，若在V(乙醇)∶V(LOA溶液)＞0.8 時(shí)加入晶種，最終結(jié)晶產(chǎn)品細(xì)小且產(chǎn)品純度較低，主要是因?yàn)槿芤旱倪^(guò)飽和度較大，越過(guò)介穩(wěn)區(qū)，進(jìn)入不穩(wěn)區(qū)，造成初級(jí)均相成核，瞬間產(chǎn)生大量的晶核;V(乙醇)∶V(LOA溶液)為0.6、0.8 時(shí)加入晶種，結(jié)晶顆粒較大、產(chǎn)品純度較高，說(shuō)明加入晶種時(shí)溶液形成的過(guò)飽和度不高，并且加入晶種會(huì)及時(shí)降低過(guò)飽和度，避免形成初級(jí)均相成核現(xiàn)象。然而，過(guò)早加入晶種作用不大，故本研究選定V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8 時(shí)，為最佳晶種添加時(shí)機(jī)。

2.2.2 晶種添加量對(duì)結(jié)晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無(wú)水乙醇，當(dāng)V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8時(shí)，分別加入大小為125 目的(約115 μm)晶種。考察0%、2%、4%、6%的晶種加入量對(duì)結(jié)晶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示，不同晶種加入量對(duì)應(yīng)的晶體顯微照片如圖3 所示。

圖3 不同晶種添加量得到的晶體照片(64 倍)Fig.3 The picture of crystal with different addition amount of crystal seed (64 times)

表2 晶種添加量對(duì)結(jié)晶的影響Table 2 Effect of crystal seeds amount on crystallization

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不添加晶種時(shí)，LOA 晶體平均粒徑較小，且產(chǎn)品純度低。這主要是因?yàn)椴惶砑泳ХN時(shí)，初級(jí)均相成核現(xiàn)象嚴(yán)重，易爆發(fā)成核，導(dǎo)致晶核數(shù)量過(guò)多，同時(shí)過(guò)飽和度也會(huì)因此降低較多，使晶體生長(zhǎng)動(dòng)力不足;2%的晶種添加量時(shí)，提供的晶體數(shù)量少，結(jié)晶面積不夠大，而體系的過(guò)飽和度較大，易產(chǎn)生初級(jí)均相成核，瞬間產(chǎn)生大量的晶核，導(dǎo)致LOA 顆粒細(xì)小、產(chǎn)品質(zhì)量差;4%、6%的晶種添加量時(shí)，逐漸增大的晶種量，增加了結(jié)晶表面積，確保了結(jié)晶顆粒在介穩(wěn)區(qū)內(nèi)生長(zhǎng)，產(chǎn)品平均粒度增大，細(xì)晶減少，在4%的晶種添加量時(shí)，平均粒度最大，純度最高;6%的晶種添加量，晶體粒度較4%的晶種添加量時(shí)小，產(chǎn)品中存在少量細(xì)晶，可能是因?yàn)榫ХN數(shù)量過(guò)大，這雖然能夠控制結(jié)晶過(guò)程在介穩(wěn)區(qū)內(nèi)進(jìn)行，但是過(guò)多的晶種會(huì)增加晶體與晶體、晶體與攪拌槳、晶體與罐壁的碰撞機(jī)會(huì)，而且在過(guò)飽和度不變的條件下過(guò)多的晶種會(huì)導(dǎo)致晶體生長(zhǎng)推動(dòng)力下降。故選擇4%的晶種添加量為最優(yōu)值。

2.3 溶析劑流加速率的優(yōu)化研究

2.3.1 第III 階段乙醇流加速率對(duì)結(jié)晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無(wú)水乙醇，當(dāng)V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8時(shí)，加入4%的晶種，攪拌養(yǎng)晶2 h，控制第III 階段乙醇流加時(shí)間分別為:120 min、240 min、360 min，而第III 階段共需要流加75 mL 乙醇，則對(duì)應(yīng)的乙醇流加速率分別為:0.63 mL/min、0.31 mL/min、0.21 mL/min。

表3 乙醇滴加速率對(duì)結(jié)晶的影響Table 3 The influence of feeding rate of ethanol to crystal

圖4 不同乙醇滴加速率的晶體照片(64 倍)Fig.4 The picture of crystal with different feeding rate of ethanol (64 times)

在結(jié)晶第III 階段流加乙醇時(shí)間長(zhǎng)短意味著結(jié)晶體系中LOA 的過(guò)飽和度不同。由粒徑分布圖和晶體照片可以看出，若以0.63 mL/min 流加乙醇，時(shí)間較短，體系中LOA 的濃度增值大于結(jié)晶速率，過(guò)飽和度不斷增加，出現(xiàn)均相成核的機(jī)會(huì)增多，因此形成的晶體顆粒細(xì)?。?4］。在0.21 mL/min 的流速下碎晶較少并且粒度分布均勻。但如果過(guò)度延長(zhǎng)結(jié)晶時(shí)間，則可能會(huì)因晶體之間、晶體與攪拌槳葉之間的碰撞增加而形成細(xì)晶。故選擇0.21 mL/min 為乙醇最佳流加速率。

2.3.2 第IV 階段乙醇流加速度對(duì)結(jié)晶的影響

取60 mL 濃度約為600 g/L 的LOA 溶液，25℃下，向體系中流加無(wú)水乙醇，當(dāng)V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8時(shí)，加入4%的晶種，攪拌養(yǎng)晶2 h，控制第III 階段乙醇流加速率為0.21 mL/min。第IV 階段共需要流加120 mL 乙醇，控制流加時(shí)間分別為90 min、150 min、210 min，對(duì)應(yīng)的流速分別為1.3 mL/min、0.8 mL/min、0.57 mL/min，考察第IV 階段乙醇流加速率不同對(duì)結(jié)晶的影響。

表4 第IV 階段乙醇滴加速率對(duì)結(jié)晶的影響Table 4 The influence of ethanol velocity of flow to crystal at stage IV

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第IV 階段乙醇流加速率為1.3 mL/min、0.8 mL/min 時(shí)，結(jié)晶產(chǎn)物中細(xì)小晶體較多，產(chǎn)品純度也較低，主要是因?yàn)橐掖剂骷铀俾蔬^(guò)快，導(dǎo)致過(guò)飽和度太大，而晶體生長(zhǎng)速率相對(duì)較小，來(lái)不及消耗產(chǎn)生的過(guò)飽和度。而流加速率過(guò)低，不利于提高生產(chǎn)效率，故最佳流加速率選擇為0.57 mL/min。

3 結(jié)論

本文介紹了L-鳥(niǎo)氨酸-阿司匹林復(fù)合鹽的制備方法，重點(diǎn)討論了其溶析結(jié)晶過(guò)程。由于在結(jié)晶的過(guò)程中，向體系加入少量的晶種有利于抑制一次成核并維持適量的二次成核，可以提高產(chǎn)品質(zhì)量。因此，文章重點(diǎn)討論了晶種加入時(shí)機(jī)以及加入量對(duì)結(jié)晶的影響。另外，根據(jù)乙醇流加量的不同將結(jié)晶過(guò)程分成了5 個(gè)階段，重點(diǎn)研究了對(duì)結(jié)晶影響較大的第III、IV 階段乙醇流加速率的不同對(duì)結(jié)晶的影響。結(jié)果表明，LOA的最優(yōu)溶析結(jié)晶工藝為:取60 mL 濃度約為600 g/L的LOA 溶液，25℃下，向體系中快速流加無(wú)水乙醇，當(dāng)V(乙醇)∶V(LOA溶液)=0.8 時(shí)，加入4%的晶種，攪拌養(yǎng)晶2 h;控制第III 階段乙醇流加速率為0.21mL/min，維持6 h;然后加大乙醇流加速率至0.5 mL/min，維持3.5 h;最后攪拌養(yǎng)晶2 h，并將體系溫度逐漸降至10℃。最終產(chǎn)品純度為97.9%，平均粒徑為270.6 μm。

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