2 株乳酸菌對亞硝酸鹽的降解作用及其降解機理的初步分析

林浩，林偉鋒，陳中

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640)

亞硝酸鹽是公認(rèn)的一種強致癌物質(zhì)［1－2］。如何控制并降低泡菜中的亞硝酸鹽含量成為食品安全領(lǐng)域研究的熱點問題。近年來，國內(nèi)外對乳酸菌降解亞硝酸鹽方面多有研究。張慶芳［3］等人認(rèn)為，乳酸菌降解亞硝酸鹽分為兩部分，在pH ＞4.5 的發(fā)酵前期主要以酶降解為主;在pH ＜4.0 的發(fā)酵后期，主要以酸降解為主。Doods 和Kim［4－6］等人也報道了植物乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、綠色乳桿菌、泡菜乳桿菌等乳酸菌都有降解亞硝酸鹽的能力。Yan［7］等人從泡菜中分離到6 株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)其在MRS 液體培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的能力都較好。

本文選用兩種常用的泡菜生產(chǎn)人工接種劑:植物乳桿菌和腸膜明串珠菌，分別接種到液體MRS 培養(yǎng)液中，測定在發(fā)酵過程中pH、總酸、活菌數(shù)及亞硝酸鹽含量變化，并分析各指標(biāo)間的相關(guān)性。試圖通過不同指標(biāo)對亞硝酸鹽降解率的影響來確定乳酸菌降解亞硝酸鹽的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:植物乳桿菌LP-L134-1-P(簡稱LP)、腸膜明串珠菌LM-L134-1-P(簡稱LM)，均來源于華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院實驗室。

MRS 固體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、牛肉膏8 g、酵母膏4 g、吐溫－80 1 g、K2HPO42 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、MgSO40.2 g、MnSO40.04 g、瓊脂15 g，加去離子水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH6.2 ±0.2

MRS 液體培養(yǎng)基:不加瓊脂，其他成分同MRS固體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-25 數(shù)顯pH 計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱;電子秤;手提式高壓滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司;紫外可見分光光度計;水浴恒溫振蕩器，金壇市宏華儀器廠;超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單菌接種降解亞硝酸鹽能力

配制好4 瓶液體MRS 培養(yǎng)液并高溫滅菌，靜置放涼后加入NaNO2(NaNO2首先在硅膠干燥器中干燥24h，然后紫外燈照射30 min 滅菌)，使其濃度均為150 mg/kg。將兩種乳酸菌(LP、LM)菌粉按菌體濃度為106CFU/mL 接種到培養(yǎng)液中，37 ℃下培養(yǎng)72 h。每隔12 h 檢測培養(yǎng)液的pH 值、總酸度、活菌數(shù)及亞硝酸鹽含量。

2 株乳酸菌降解亞硝酸鹽能力以亞硝酸鹽降解率來表示。

亞硝酸鹽降解率/% =( 亞硝酸鹽初始含量－降解后的亞硝酸鹽含量) /亞硝酸鹽初始含量×100

1.3.2 去離子水中直接添加乳酸降解亞硝酸鹽

取去離子水添加NaNO2至其濃度為100 mg/L，分別添加乳酸至溶液pH 分別為6、5、4、3，并設(shè)置空白對照。所有處理在500 mL 錐形瓶中進(jìn)行，裝液量為250 mL，用透氣紗布封口，實驗期間將錐形瓶置于37 ℃恒溫箱靜置，定時檢測溶液中亞硝酸鹽濃度的變化。

1.4 測定方法

1.4.1 pH 的測定

PHS-25 型酸度計。每個樣品重復(fù)3 次，取平均值。

1.4.2 總酸度的測定

培養(yǎng)液中的酸性物質(zhì)主要成分是乳酸等有機酸，用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以PHS-25 型酸度計測定，終點8.2，結(jié)果以乳酸表示。

1.4.3 活菌數(shù)的測定

活菌數(shù)測定采用平板計數(shù)法。

1.4.4 亞硝酸鹽測定

采用GB/T5009.33 －2003 方法中鹽酸萘乙二胺分光光度計比色法，樣品重復(fù)測定3 次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 活菌數(shù)和亞硝酸鹽降解率的變化值及規(guī)律

考察了在培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量106CFU/mL的條件下LP 和LM 在NaNO2濃度為150 mg/kg 的MRS 液體培養(yǎng)液中發(fā)酵72 h 內(nèi)活菌數(shù)、亞硝酸鹽降解率的變化，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 培養(yǎng)液中活菌數(shù)與亞硝酸鹽降解率變化值Fig 1 Changes of samples in viable cell numbers and nitrite degradation rate during fermentation

從圖1 中可以看出，2 株乳酸菌在液體MRS 培養(yǎng)液中均能較好的生長。從進(jìn)入對數(shù)期的時間長短來看，LM 需要的時間更短，增長速率也更快。LM 在培養(yǎng)12 h 后細(xì)菌總數(shù)可由剛接種時的1.6 × 106CFU/mL 達(dá)到菌體最高生長濃度1.49 × 108CFU/mL。從能夠得到的最高菌體濃度來看，LP 能達(dá)到1.97 ×109CFU/mL，活菌數(shù)遠(yuǎn)高于LM。2 株菌都在培養(yǎng)36 h 后開始進(jìn)入衰亡期，之后活菌數(shù)急劇下降。隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量都在減少，但LP 在降解速率、能力上明顯要優(yōu)于LM。培養(yǎng)12 h 后，LP 和LM 對亞硝酸鹽的降解率分別只有15.36%及18.47%。結(jié)合其生長曲線來看，在培養(yǎng)的前12 h 兩種乳酸菌正處于遲滯期和對數(shù)期前期，細(xì)菌生長活動不旺盛，對亞硝酸鹽的降解率偏低。而從12 h 開始，LP 對亞硝酸鹽的降解率開始快速增長，到36 h 降解率已經(jīng)達(dá)到96.25%，對亞硝酸鹽的降解基本已達(dá)到頂峰?？赡苁窃谶@段時間內(nèi)LP 處于生長的對數(shù)期，細(xì)菌代謝旺盛，細(xì)胞分泌亞硝酸鹽還原酶量、產(chǎn)酸量增多，從而達(dá)到分解破壞亞硝酸鹽的效果。與LP 相比，LM 降解亞硝酸鹽能力很弱，在培養(yǎng)的72 h 內(nèi)對亞硝酸鹽的降解率呈緩慢上升趨勢，72 h 后降解率才達(dá)到最高，僅為38.77%。

2.2 pH 和亞硝酸鹽降解率變化值及規(guī)律

由圖2 可以看出，LP、LM 在發(fā)酵過程中pH 變化趨勢區(qū)別明顯。LM 在發(fā)酵的72 h 內(nèi)pH 變化幅度不大，僅由6.2 下降至5.35。結(jié)果表明LM 產(chǎn)酸能力很弱，pH 的變化與其所處的生長周期并沒有很大的聯(lián)系。LP 在培養(yǎng)的72 h 內(nèi)pH 由6.22 降至3.87，下降幅度很大。其中，在培養(yǎng)的前12 h 內(nèi)pH 變化幅度較小。在12 ～36 h 內(nèi)LP 的pH 下降速度很快，之后變化幅度漸趨緩和，這與其活菌數(shù)變化曲線結(jié)果是相一致的。LP 在前12 h 內(nèi)是處于遲滯期，乳酸菌發(fā)酵增長緩慢。在12 ～36 h 內(nèi)LP 處于對數(shù)期，乳酸菌開始快速產(chǎn)酸，故pH 變化很快。之后LP 處于穩(wěn)定期、衰亡期，隨著生長環(huán)境中酸度的持續(xù)積累，高濃度的酸開始對細(xì)菌的生長起抑制作用，活菌數(shù)隨之下降。綜合2 株乳酸菌亞硝酸鹽降解率曲線來看，pH 的降低能夠有效促進(jìn)乳酸菌降解亞硝酸鹽。從降解效果來看，pH 在大于5.60 時，LM 對亞硝酸鹽的降解較少，只有30%左右。而LP 培養(yǎng)液中pH 開始降至4 或以下時，亞硝酸鹽含量下降迅速，降解率可達(dá)到80%以上，這與張慶芳［3］等人的研究結(jié)果一致。

2.3 總酸和亞硝酸鹽降解率變化值及規(guī)律

從圖3 可以看出，2 株菌在培養(yǎng)過程中的總酸與亞硝酸鹽降解率變化趨勢基本一致。LM 產(chǎn)酸能力很弱，在發(fā)酵的72 h 內(nèi)總酸由0.23%升至0.34%，上升趨勢緩慢。與之對應(yīng)的是其對亞硝酸鹽的降解率，發(fā)酵72 h 后降解率僅達(dá)到38.77%。LP 產(chǎn)酸迅速，在培養(yǎng)的72 h 內(nèi)總酸由0.20%升至1.80%。在培養(yǎng)的12 ～36 h 內(nèi)，LP 處于對數(shù)期，酸度上升極快，由0.35%上升到1.492%。這段時間內(nèi)LP 對亞硝酸鹽的降解速率也由15.36%上升到96.25%，與總酸的上升趨勢極為吻合。

圖2 培養(yǎng)液中pH 與亞硝酸鹽降解率變化值Fig 2 Changes of samples in pH and nitrite degradation rate during fermentation

圖3 培養(yǎng)液中總酸與亞硝酸鹽降解率變化值Fig 3 Changes of samples in total acid and nitrite degradation rate during fermentation

2.4 各指標(biāo)之間相關(guān)性分析

用SPSS 軟件對培養(yǎng)液中pH、總酸、活菌數(shù)和亞硝酸鹽降解率簡單相關(guān)性如表1 所示。由表1 可知，在接入LM、LP 的培養(yǎng)液中，pH 與亞硝酸鹽降解率之間的Pearson Correlation 分別為－0.974 和－0.985，|r|均大于0.8，可見培養(yǎng)液中的pH 與亞硝酸鹽降解率之間呈高度負(fù)相關(guān)。同樣地，兩種培養(yǎng)液中總酸含量與亞硝酸鹽降解率之間的Pearson Correlation 分別為0.989、0.998，呈高度的正相關(guān)。這表明pH 越小、總酸越高，亞硝酸鹽降解率越高。這主要是因為乳酸菌在培養(yǎng)過程中不斷產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中H+濃度的升高(即pH 的降低和總酸的升高)。較高的酸度可以分解破壞亞硝酸鹽，從而使亞硝酸鹽降解率升高。而LM、LP 培養(yǎng)液中的活菌數(shù)與亞硝酸鹽降解率之間的Pearson 相關(guān)性僅為－0.067、0.273，|r| ＜0.3，可認(rèn)為兩者之間不相關(guān)。活菌數(shù)數(shù)量的多少反應(yīng)了乳酸菌所分泌的亞硝酸鹽還原酶量的多少，由此說明LM、LP 對亞硝酸鹽的酶降解所起作用并不明顯，起主要作用的是酸降解。另外，相較于pH 對亞硝酸鹽降解率的影響，總酸與亞硝酸鹽降解率之間相關(guān)性更為顯著。說明乳酸菌對亞硝酸鹽的酸降解除了游離的H+對亞硝酸鹽的分解破壞，乳酸菌在發(fā)酵過程中分泌的乳酸等有機酸也有促進(jìn)作用。乳酸單獨對亞硝酸鹽的清除作用需要在下一步實驗中進(jìn)行印證。

表1 培養(yǎng)液中pH、總酸、活菌數(shù)與亞硝酸鹽降解率之間相關(guān)性Table 1 Correlation analysis between pH，total acid，viable cell numbers and nitrite degradation rate

2.5 直接添加乳酸對降解亞硝酸鹽的影響

從圖4 可以看出，往去離子水中添加乳酸后，隨著時間的推移亞硝酸鹽含量都出現(xiàn)不同程度的下降，而對照組亞硝酸鹽含量基本不變。添加的乳酸濃度越多，即溶液初始pH 值越低，亞硝酸鹽含量下降的趨勢越明顯，原因是乳酸可以通過與亞硝酸鹽發(fā)生歧化反應(yīng)2H++3NO2－ = NO3+2NO↑+ H2O 去除亞硝酸鹽。當(dāng)添加乳酸調(diào)節(jié)溶液初始pH 值在5 以上時，亞硝酸鹽的降解率在24 h 內(nèi)不足20%，降解效果不顯著。當(dāng)添加乳酸至溶液初始pH 為4 或以下時，亞硝酸鹽含量下降明顯，其中初始pH 為3 時，亞硝酸鹽含量下降速率很快，在第10 h 的時候降解率即可達(dá)到81.98%。這與之前LP 培養(yǎng)液在pH 下降到4 以后對亞硝酸鹽的降解率急劇增加的結(jié)果是一致的。綜合LP、LM 兩株菌降解亞硝酸鹽的結(jié)果，進(jìn)一步印證了乳酸菌降解亞硝酸鹽主要是依靠酸降解。

從圖5 可以看出:培養(yǎng)液初始pH 越低，總酸含量也越低，添加乳酸的培養(yǎng)液在24 h 內(nèi)總酸含量變化并不明顯，可能是因為亞硝酸鹽含量比較少所以消耗的乳酸量也較少的緣故。初始pH 為3 的培養(yǎng)液中總酸含量在1.06%左右，初始pH 為4、5、6 的去離子水中總酸含量均低于0.2%。結(jié)合前面的數(shù)據(jù)可以推斷出:培養(yǎng)液中pH 降至3 以下、總酸升至1.06%以上時對亞硝酸鹽的降解效果明顯。

圖4 添加乳酸后去離子水中亞硝酸鹽降解率的變化Fig 4 Variation trend of nitrite degradation rate in deionized water after adding lactic acid

圖5 添加乳酸后去離子水中總酸含量的變化Fig 5 Variation trend of total acid in deionized water after adding lactic acid

3 結(jié)論

(1)在提供充足營養(yǎng)的情況下，LM、LP 兩株乳酸菌都有降解亞硝酸鹽的能力，從亞硝酸鹽降解速率和降解量來看，LP 對亞硝酸鹽的去除效果要好于LM。

(2)在培養(yǎng)的前12 h 內(nèi)，乳酸菌處于遲滯期，培養(yǎng)液中的pH 偏高、總酸度偏低，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解可能主要依靠乳酸菌分泌的亞硝酸鹽還原酶，但酶降解效果并不十分顯著。

(3)2 株乳酸菌培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽降解率與pH 值呈顯著的負(fù)相關(guān)，與總酸度呈顯著的正相關(guān)，與活菌數(shù)的變化并無明顯關(guān)系。說明乳酸菌降解亞硝酸鹽主要的影響因素是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸，pH 越小、總酸越高，亞硝酸鹽降解率越高。

(4)相較于pH 對亞硝酸鹽降解率的影響，總酸與亞硝酸鹽降解率之間相關(guān)性更為顯著。說明乳酸菌對亞硝酸鹽的降解除了培養(yǎng)液中游離的H+對亞硝酸鹽的分解破壞，乳酸菌在發(fā)酵過程中分泌的乳酸等有機酸也有促進(jìn)作用。

(5)往去離子水中添加更高濃度的乳酸，降解亞硝酸鹽效果也越顯著。當(dāng)初始溶液pH 值調(diào)節(jié)至3(總酸為1.04%左右)時，在10 h 后降解率即可達(dá)到81.98%，進(jìn)一步驗證了乳酸菌降解亞硝酸鹽主要依靠酸降解。

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