柿葉提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷保護作用的研究

張 艷，楊建雄，馬 蕊，王 芳

（陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安710062）

柿（Diospyros kakiL．f）為雙子葉植物柿樹科 柿樹，柿葉為柿的新鮮或干燥葉片．黃酮類化合物是柿葉的主要有效成分［1］，主要以苷類形式存在［2］．已發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有蘆丁、黃芪苷（astraglin）、異槲皮素（isoquereitrin）、山奈酚（Kaempferol）等．目前對柿葉黃酮的研究主要集中在軟化血管、降脂降壓、抗氧化、止血等藥理方面［3］，而對其保肝作用尤其是對CCl4誘導的急性肝損傷保護作用的研究卻較少．本研究探討柿葉醇提物乙酸乙酯萃取制劑（EAF）對四氯化碳（CCl4）急性肝損傷的保護作用，為柿葉在保健食品中的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)．

1 材料和方法

1．1 試劑

ALT、AST、AKP、SOD、GPx、CAT、MDA試劑盒均由南京建成生物工程有限公司提供．化學試劑均為國產分析純，EAF（黃酮含量為81．05%）溶液為自制．

1．2 動物

雄性昆明種小鼠，50只，體重（20±2）g，由西安交通大學實驗動物研究中心提供．

1．3 方法

1．3．1 動物模型與藥物處理 選擇50只雄性昆明種小鼠，隨機分組，每組10只，分別為正常組、模型組（CCl4）、EAF組（低劑量組50mg／kg、中劑量組100mg／kg、高劑量組200mg／kg）．小鼠適應性喂養(yǎng)7d后，給藥組采用灌胃給藥，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水．每隔3d稱一次體重，根據(jù)體重調整給藥體積．連續(xù)7d后，除正常對照以外，其余各組于末次給藥3h后按20mg／kg劑量腹腔注射2%CCl4花生油［4］，正常組注射等體積的花生油，禁食不禁水．24h后眼眶采血，分離血清待用．取血后每只小鼠立即剖腹，取相同部位的一小塊肝組織，用10%的福爾馬林溶液固定，同時用生理鹽水制備成10%的肝勻漿，離心，上清液4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

1．3．2 肝功能生化檢測 血清ALT、AST和AKP活性按試劑盒說明測定．

1．3．3 肝組織生化測定 肝勻漿SOD、GPx、CAT活性及MDA含量按試劑盒說明測定．

1．3．4 肝臟組織病理學檢查 肝組織切片經(jīng)HE染色，光鏡下觀察肝細胞損傷程度．

1．3．5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS14．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結果以±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析．

2 結果與討論

2．1 對小鼠血清ALT、AST和AKP的影響

如表1所示，模型組血清中ALT、AST、AKP的含量明顯高于正常組（P＜0．01），與CCl4模型組比較，EAF不同給藥組均能顯著降低ALT、AST、AKP活性，其中以中劑量組效果最為顯著．CCl4進入體內后，經(jīng)肝微粒體細胞色素P450酶激活，生成三氯甲基自由基（CCl3·），CCl3·可進一步與氧反應，形成具有更強反應活性的CC13O2·，這些自由基與肝細胞內大分子發(fā)生共價結合，也可攻擊肝細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化，引起膜結構和功能完整性的破壞，導致肝細胞腫脹壞死．肝臟內ALT以及AST外流，EAF不同劑量給藥組均能顯著降低ALT、AST、AKP活性．表明EAF可能通過清除自由基［5］，穩(wěn)定肝細胞膜正常結構，加強組織修復，抑制脂質過氧化而減輕肝細胞損害．

表1 EAF對小鼠血清ALT、AST及AKP活力的影響Tab．1 Effects of EAF on serum ALT，AST and AKP in carbon tetrachloride intoxicated mice U／L，±s，n＝10

表1 EAF對小鼠血清ALT、AST及AKP活力的影響Tab．1 Effects of EAF on serum ALT，AST and AKP in carbon tetrachloride intoxicated mice U／L，±s，n＝10

注：與正常組比較＊＊P＜0．01，＊P＜0．05；與模型組比較＃＃P＜0．01，＃P＜0．05．

組別ALT AST AKP模型組144．8±10．1＊＊98．68±3．41＊＊427．1±36．80＊＊正常組4．82±2．27 46．97±1．86 157．8±20．09低劑量（50mg／kg）＋CCl4109．3±18．1＃69．16±1．46＃＃281．9±29．40＃＃中劑量（100mg／kg）＋CCl489．02±21．3＃＃65．81±6．09＃＃250．2±24．66＃＃高劑量（200mg／kg）＋CCl4126．2±5．93＃72．90±4．41＃293．1±30．09＃

2．2 對小鼠肝組織SOD、GPx、CAT活性及MDA含量的影響

如表2所示，與正常組比較，CCl4顯著降低了模型組小鼠肝勻漿SOD、CAT（P＜0．01）及GPx活性（P＜0．05），同時MDA含量顯著升高（P＜0．05）．與模型組比較，EAF對這些變化都有不同程度的抑制作用．其中低、中劑量與模型組比較差異均有顯著性（P＜0．01或P＜0．05），而高劑量組SOD、CAT、GPx活性有所增強，MDA含量有所降低，但沒有統(tǒng)計學意義（P＞0．05）．

表2 EAF對小鼠肝勻漿SOD、GPx、CAT活性及MDA含量的影響Tab．2 Effects of EAF on MDA，SOD，GPx，and CAT in liver homogenate of in carbon tetrachloride intoxicated mice ±s，n＝10

表2 EAF對小鼠肝勻漿SOD、GPx、CAT活性及MDA含量的影響Tab．2 Effects of EAF on MDA，SOD，GPx，and CAT in liver homogenate of in carbon tetrachloride intoxicated mice ±s，n＝10

注：與正常組比較＊＊P＜0．01，＊P＜0．05；與模型組比較＃＃P＜0．01，＃P＜0．05．

組別SOD（U／mg protein）GPx（U／mg protein）CAT（U／mg protein）MDA（nmol／mg protein）模型組70．79±12．37＊＊526．9±56．53＊30．80±9．93＊＊2．72±0．95＊正常組216．9±40．84 712．6±141．9 73．62±1．78 1．19±0．07低劑量（50mg／kg）＋CCl4105．6±19．34＃567．3±38．42 56．70±13．6＃1．53±0．58＃中劑量（100mg／kg）＋CCl4120．4±23．26＃640．3±43．04＃60．06±10．1＃＃1．47±0．38＃＃高劑量（200mg／kg）＋CCl498．04±19．22 562．0±86．52 42．70±9．92 2．13±0．45

SOD是細胞內主要的防御性抗氧化酶，減少自由基的產生，減輕肝細胞的損傷．MDA能進入膜脂的水相，和膜蛋白、膜磷脂上的—NH2交聯(lián)形成schiff堿，使細胞膜流動性降低，通透性增加，從而導致膜的功能損傷或喪失［6］．GPx可以催化GSH與各種內源性和外源性親電子化合物反應，生成無毒性或毒性小的GSH硫結合物．CAT既能有效及時地消除體內細胞代謝產生的毒性物質過氧化氫，又可充當血紅蛋白和其他含巰基蛋白的保護劑．這一系列抗氧化酶及脂質過氧化產物的相應變化反映了EAF具有強的清除自由基的能力，其主要成分黃酮類化合物含有的羥基具有很強的供氫能力，可以通過釋放羥基上活潑H原子，使其與R·或ROO·結合，向活潑自由基提供H后，可與其他自由基結合成穩(wěn)定的二聚體，而切斷自由基的鏈式反應，發(fā)揮抗氧化作用［7］．

2．3 EAF對小鼠肝組織病理學的影響

病理切片結果見圖1．光鏡所見正常組小鼠肝小葉結構正常、清晰，細胞排列整齊，大小均勻，細胞核位于細胞中央，圓而邊界清．模型組小鼠肝細胞明顯水腫、氣球樣變，肝索排列紊亂，肝細胞解離，肝小葉內點狀壞死，中央靜脈和匯管區(qū)出現(xiàn)彌漫性的炎

圖1 EAF對急性肝損傷小鼠肝組織病理改變的影響（HE×400）Fig．1 The histopathological analysis for effect of EAF on acute liver injure in mice（HE，×400）

細胞浸潤．低、高劑量組肝細胞仍出現(xiàn)部分空 泡、變性，較模型組有所改善，但效果不明顯．中劑量組細胞核結構清晰，體積正常，水腫、壞死、氣球樣變、炎細胞浸潤程度明顯減輕，較模型組有顯著改善．

結果表明，中劑量（100mg／kg）的柿葉黃酮有較好的保肝效果，而200mg／kg的劑量對肝細胞氧化損傷的保護作用減弱，這一結果與生化測定所得結果一致，也與文獻［8－9］報道的較高劑量的酚酸類物質對肝細胞有損害作用的結論一致．

3 結論

EAF對CCl4致小鼠急性肝損傷有一定的保護作用，100mg／kg的EAF效果較好．其機理可能與降低脂質過氧化反應，清除自由基，保護肝細胞膜，維持膜的正常通透性等有關．這一結果表明，廢棄的柿葉可以用來制備對肝臟有一定保護作用的EAF．

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