多耐藥鮑曼不動桿菌噬菌體IME-AB6的分離、生物特性及保存方法研究

彭帆，童貽剛，柏長青

1.中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室；b.附屬醫(yī)院呼吸危重癥科；北京 100071

鮑曼不動桿菌廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌，多感染老年患者、危重患者、腫瘤放化療等抵抗力低下的患者，尤其是重癥監(jiān)護室的患者。隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素的運用，多耐藥鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院的主要病原體[1]。噬菌體是針對耐藥菌治療與消毒的一種有效手段[2]。我們通過生物學(xué)方法，對多耐藥鮑曼不動桿菌噬菌體進行了分離，并對分離的噬菌體的形態(tài)、一步生長曲線、裂解特性和不同保存條件對其活性的影響進行了初步研究,為噬菌體制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鮑曼不動桿菌AB6分離自解放軍307醫(yī)院患者血液，用VITEK-2全自動微生物檢測儀進行菌種及藥敏測定。

1.2 噬菌體分離與純化

從解放軍307醫(yī)院取消毒前污水離心，除去固體雜質(zhì)，收集上清，再經(jīng)濾器過濾上清；取4 mL濾液加到2 mL 3×LB中，加入100 μL培養(yǎng)至對數(shù)期的鮑曼不動桿菌富集；過夜培養(yǎng)后離心收集上清，經(jīng)濾器過濾后的濾液即為噬菌體原液[3]；以LB固體培養(yǎng)基做下層平板，將上述濾液梯度稀釋，分別取100與500 μL指示菌加入上層半固體LB培養(yǎng)基中，凝固后于37℃培養(yǎng)6 h，觀察噬菌斑，計算滴度；挑單個噬菌斑挑入對數(shù)期菌液中過夜富集，離心過濾后與指示菌鋪板，連續(xù)幾次便得到純化的噬菌體[4]。

1.3 噬菌體濃縮

將單個噬菌斑挑入5 mL對數(shù)期菌液中6 h，之后將其接種于500 mL對數(shù)期菌液中，37℃過夜培養(yǎng)；在含噬菌體的裂解培養(yǎng)物中加入0.1%體積的氯仿，室溫靜置30 min；向培養(yǎng)物中加入NaCl（終濃度為1 mol/L），攪拌使其溶解；將培養(yǎng)物冰浴1 h，4℃、11 000×g離心10 min去除細胞碎片；將培養(yǎng)物的上清加固體聚乙二醇（PEG）至終濃度為100 g/L，室溫下用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解PEG[5]；將溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中，冰水浴冷卻，至少放置1 h，以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀；4℃、11 000×g離心10 min回收沉淀的噬菌體，去上清，將噬菌體沉淀輕輕重懸于SM中；加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的PEG和細胞碎片，溫和振蕩30 s；11 000×g離心10 min分離有機相和親水相，回收含噬菌體顆粒的親水相，經(jīng)0.22 μm濾器過濾，4℃保存。

1.4 透射電鏡形態(tài)觀察

取25 μL噬菌體液滴在銅網(wǎng)上，待其沉淀15 min，用濾紙吸去多余液體，用2%的磷鎢酸染色30 min，干燥后用Philip TECNAI-10透射電鏡進行形態(tài)觀察[6]。

1.5 一步生長曲線

在1.5 mL EP管中加入感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1的噬菌體及其宿主菌（D600nm=0.6），混勻，37℃溫育15 min，11 000 ×g離心 30 s，吸去上清，再用預(yù)熱的LB培養(yǎng)液洗滌2次（11 000 ×g離心30 s），棄上清，用預(yù)熱的LB液混懸沉淀并充分混勻，加入含5 mL預(yù)熱的LB液體的試管中，迅速于37℃搖床上振蕩培養(yǎng)，同時開始計時，分別在0、10、20、30、40、50、60、90、120 min取出 0.2 mL，13 000 r/min離心 2 min，吸取100 μL上清，用預(yù)熱的LB液倍比稀釋后，用雙層瓊脂法測定噬菌體滴度[7]。

1.6 溫度敏感性測定

將噬菌體原液分別置于50、60、70和80℃的恒溫水浴中[8]，經(jīng)梯度稀釋后，采用雙層瓊脂法分別測定水浴1 h的噬菌體存活數(shù)目。

1.7 噬菌體裂解特性分析

將鮑曼不動桿菌于5 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測定其起始D600nm值，加入200 μL噬菌體（濃度為1010PFU/mL）IME-AB6，于37℃振蕩培養(yǎng)，同時以不加噬菌體作為對照組，分別于 0、1、2、3、4 h 檢測D600nm值的變化[9]。

1.8 保存方法

將效價為1013PFU/mL的噬菌體IME-AB6在LB液體培養(yǎng)基中分別存放于4、-20和-70℃[10]，分別于0、1、2、3、4、6個月時經(jīng)梯度稀釋后測定其滴度。

2 結(jié)果

2.1 細菌藥敏結(jié)果

細菌藥敏結(jié)果見表1，此株鮑曼不動桿菌耐多種藥物，表1頁給出了其最小抑菌濃度（MIC）。

2.2 噬菌斑的觀察與滴度測定

以多耐藥鮑曼不動桿菌AB6為宿主菌分離出一株噬菌體，命名為IME-AB6。經(jīng)3～5次純化后，用雙層瓊脂平板培養(yǎng)的噬菌斑呈圓形，大小均一，邊緣光滑，透明，直徑約3 mm（圖1），具有強裂解性噬菌體的噬菌斑特征。統(tǒng)計噬菌斑數(shù)，計算得本試驗中分離純化的噬菌體效價為1×1010pfu/mL，經(jīng)PEG濃縮后的滴度達1×1013pfu/mL，提高了3個數(shù)量級。

2.3 噬菌體的形態(tài)觀察

純化的噬菌體IME-AB6顆粒經(jīng)負染色后于透射電鏡下觀察其顆粒形態(tài)（圖2）。該噬菌體呈現(xiàn)典型的二十面體頭部和尾部結(jié)構(gòu)，頭部寬約40 nm，長約100 nm，尾部長60 nm，其下附有數(shù)根尾絲，因此該噬菌體屬于肌尾噬菌體科。

表1 多耐藥鮑曼不動桿菌AB6的藥敏試驗結(jié)果

2.4 一步生長曲線

圖3顯示噬菌體感染細菌的潛伏期約10 min，爆發(fā)時間約40 min。感染宿主菌在D600nm為0.6時，細菌計數(shù)為5×107/mL，裂解量=爆發(fā)末期噬菌體滴度/感染宿主菌濃度=8×109/5×107=160，即噬菌體的爆發(fā)量為160 pfu/細胞。不同噬菌體的潛伏期、爆發(fā)期及爆發(fā)量的差異很大。對于那些在臨床上有應(yīng)用前景的噬菌體而言，潛伏期短、爆發(fā)量大是特別被看好的。

2.5 溫度敏感性測定

IME-AB6對熱較敏感，50℃保存1 h其存活率約為80%，60℃時存活率明顯下降，70℃時完全失活（圖4）。40～50℃下噬菌體能保持較高滴度，表示其在相對高溫下有一定的穩(wěn)定性。

圖1 以多耐藥鮑曼不動桿菌為指示菌分離出的噬菌體IME-AB6

圖2 噬菌體IME-AB6電鏡圖

圖3 噬菌體IME-AB6在宿主菌中的一步生長曲線

2.6 噬菌體裂解特性分析

如圖5所示，在不同起始D600nm值的菌液中加入噬菌體2 h后，其D600nm值下降明顯，肉眼可觀察到較對照組明顯澄清，作用 4 h后培養(yǎng)液透亮且澄清，而陰性對照組D600nm值仍在上升且培養(yǎng)液較為混濁。由此可見，噬菌體IME-AB6能有效裂解宿主菌，裂解效能強，裂解時間快。

2.7 保存方法

圖4 噬菌體IME-AB6在不同溫度下1 h后的滴度變化

圖5 不同濃度菌液中加入噬菌體后的D600nm值變化

表2 不同保存溫度對噬菌體效價的影響（PFU/mL）

從表2可見，4℃是最好的保存溫度，4℃保存與-70℃保存的噬菌體之間無明顯差別，6個月之內(nèi)噬菌體的效價降低不明顯。-20℃保存時，噬菌體的裂菌活性在半年內(nèi)降低了多個指數(shù)級。綜合來看，在LB培養(yǎng)基中于4℃保存噬菌體不需要特殊儀器，條件簡單，操作方便，是最值得采用的保存方法。

3 討論

治療耐藥性細菌已成為臨床醫(yī)生的難題，新的抗菌藥物亟待開發(fā)[11]。但一種新抗生素的生產(chǎn)需要大量物力、人力和長時間的投入，而噬菌體治療能克服這些缺點。我們選取的鮑曼不動桿菌AB6對耐大多數(shù)藥物，以它為指示菌分離的噬菌體IME-AB6的裂解性強。雖然已有很多關(guān)于利用噬菌體治療人類疾病的報道[12-13]，但宿主譜狹窄一直是治療中存在的問題。有很多雞尾酒療法的報道[14-15]，即將不同的噬菌體混合以提高宿主譜。另一種發(fā)展趨勢是個體化治療，即針對抗生素無效或治療不明顯的某個病人的某種耐藥菌分離噬菌體用于治療，這樣宿主譜狹窄就不再是影響治療的問題。

基于噬菌體在抗菌方面的獨特優(yōu)勢，我們開展了針對多耐藥性鮑曼不動桿菌噬菌體生物學(xué)特征的初步研究，從污水中分離出一株IME-AB6噬菌體，屬于肌尾噬菌體。一步生長曲線是研究噬菌體裂解細菌效能的重要指標，包括潛伏期、爆發(fā)期、平臺期，也可以據(jù)其算出爆發(fā)量。隨著宿主菌的不斷裂解和新的子代噬菌體的釋放，當宿主菌接近全部被裂解時，噬菌體的數(shù)量達到最大值。本株噬菌體潛伏期為10 min，顯示的爆發(fā)時間是40 min。潛伏期和爆發(fā)期的時間短，可反映噬菌體裂解的高效能。噬菌體具有天然殺菌特性，而本實驗所分離的IME-AB6噬菌體能使菌液D600nm值迅速下降，在4 h內(nèi)能使菌液變清晰，也證實了其殺菌的高效能，為今后開發(fā)噬菌體制劑提供了基礎(chǔ)。在50℃以下能很好地保持噬菌體的高滴度，在LB培養(yǎng)基中于4℃保存也很方便，說明該噬菌體穩(wěn)定并易于保存，這是其作為制劑的一大優(yōu)勢。

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