匍匐莖草本蛇莓RAPD反應體系優(yōu)化

廖信軍，李雅宜，胡雪華

匍匐莖草本蛇莓RAPD反應體系優(yōu)化

*廖信軍，李雅宜，胡雪華

（井岡山大學生命科學學院，江西，吉安 343009）

為了建立蛇莓RAPD反應的最佳反應體系，我們對每個反應因子進行優(yōu)化研究。在本實驗室常用的RAPD反應體系的基礎(chǔ)上，根據(jù)RAPD擴增效果確定蛇莓基因組DNA的最佳RAPD反應體系。經(jīng)優(yōu)化后，我們建立了適合蛇莓的最佳RAPD反應體系：25 μL反應體系中含10×Buffer 2.5 μL，2 mmol/L Mg2+，1.5 UTaqDNA聚合酶，50 ng模板，0.22 mmol/L dNTPs，0.35 μmol/L隨機引物S30。本研究結(jié)果為下一步野生蛇莓遺傳多樣評估奠定基礎(chǔ)。

蛇莓；RAPD；擴增程序

蛇莓()為薔薇科多年生草本植物，其性味甘、苦、寒，具有清熱涼血、消腫解毒之功效，臨床上應用于治療熱病、驚癇、咽喉腫痛、咳嗽吐血、蛇蟲咬傷等[1-3]。目前，蛇莓中化學成分分析研究較多[4-6]，而有關(guān)蛇莓分子遺傳標記研究鮮有報道，僅姚旭麗等人2009年進行了蛇莓ISSR-PCR體系的建立和優(yōu)化的研究[7]。RAPD由Williams和We1sh兩個研究小組兒乎同時于1990年建立起來的一項分子標記技術(shù)，是目前中藥研究者最常使用的DNA標記技術(shù)[8-9]。但RAPD易受各種因素的干擾，其最佳擴增條件在不同物種各有不同，因此，在對不同物種進行RAPD分析時，完全有必要對各因子的反應條件進行優(yōu)化，建立穩(wěn)定的、最佳的反應體系。本研究將對蛇莓RAPD體系進行優(yōu)化，為進一步評估野生蛇莓群體遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為野生蛇莓群體，采自吉安市井岡山大學校園內(nèi)。每個植株上摘取莖尖端的少量幼葉，編號然后置于保鮮袋中，密封保存，放到冰壺內(nèi)，帶回實驗室后洗凈晾干，并于當日提取基因組DNA。

1.2 基因組DNA提取

參考改良CTAB法[10]提取基因組DNA。

1.3 DNA濃度及純度檢測

提取的DNA先進行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后經(jīng)紫外分光光度計（Eppendorf）檢測其濃度和純度，最后用ddH2O稀釋至25 ng/μL。

1.4 試劑

試驗所用MgCl2、dNTPs、Taq DNA聚合酶均購自上海生工，隨機引物由上海生工合成。

1.5 RAPD反應

以蛇莓基因組DNA為模板，對已篩選的S30（5’－3’依次為GTGATCGCAG）隨機引物進行擴增（德國Biometra-T3000ThermocyclerPCR儀）。本實驗對影響擴增結(jié)果的模板濃度、鎂離子濃度、Taq酶、引物濃度、dNTPs濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等主要因子進行依次研究。在保持其他因子不變的情況下，按一定梯度改變單一因子進行擴增，篩選最優(yōu)條件，以獲得最優(yōu)化、最穩(wěn)定的反應體系（各因子梯度見表1）。

1.6 RAPD擴增產(chǎn)物檢測

RAPD產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（含Goldview）電泳（10 V/cm，35 min）分離，DNA Ladder范圍為100~3000 bp，YLN-2000凝膠成像儀觀察照相。

表1 RAPD反應體系各成分優(yōu)化試驗設計

注：反應總體積25μL（含10×buffer 2.5μL）

2 結(jié)果與分析

2.1 模板DNA

基本反應體系：2.5 μL 10*Buffer，2 μL 1.8 mmol/L MgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL dNTP，0.4 μL primer，dd H2O 補充至25 μL。 DNA優(yōu)化分5個濃度梯度進行：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ng/μL。結(jié)果見圖1：模板DNA用量在0.5~2.5 ng/μL的范圍內(nèi)均能擴增出條帶，當濃度為0.5 ng/μL時條帶稍淡，濃度為2 ng/μL時條帶最清晰。因此，我們最后選取了濃度為2.0 ng/μL (總含量50 ng)為最佳模板濃度。

M: SM0321 Marker

2.2 引物

引物濃度低時，無法與所有的模板DNA結(jié)合位點結(jié)合，導致擴增結(jié)果不理想；引物濃度過高時，會增加堿基錯配的機率，產(chǎn)生非特異性條帶。本研究，基本反應體系：2.5 μL 10*Buffer，2 μL1.8 mmol/L MgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL dNTP，50 ng DNA，dd H2O 補充至25 μL，引物設計了5個梯度（依次為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 μmol/L）。結(jié)果見圖3：引物濃度小于0.2 μmol/L時條帶淡且數(shù)目明顯更少，引物濃度在0.4~0.5 μmol/L較其它濃度更清晰，出于節(jié)約成本最終確定的引物采用量為0.4 μmol/L。

M: SM0321 Marker

2.3 dNTP

dNTPs是反應中磷酸根的主要來源，其濃度大小直接影響產(chǎn)物的質(zhì)量，特異性及合成的可靠性[11]。本研究基本反應體系：2.5 μL 10*Buffer， 2 μL 1.8 mmol/LMgCl2，0.5 μL 2.0 U TaqDNA聚合酶，50 ng DNA，0.4 μL primer，dd H2O 補充至25μL，dNTP在120~240 μmol/L之間，設置了5個濃度梯度，分別為120，160，200，220，240 μmol/L。結(jié)果見圖2。

M: SM0321 Marker

注：條帶從強到弱的濃度依次為，220，200，160，240，120μmol/L。故，選擇dNTP終濃度為220 μmol/L進行RAPD擴增。

2.4 Mg2+濃度

Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，濃度過高會使反應特異性降低，濃度過低又會降低Taq酶的活性，使反應產(chǎn)物減少[12]。本研究基本反應體系：2.5 μL 10*Buffer，2.2 μL dNTP，0.5 μL 2.0U TaqDNA聚合酶，50ng DNA，0.4 μL primer，dd H2O 補充至25 μL，Mg2+濃度設置了5個濃度梯度（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L）。結(jié)果見圖4：當Mg2+濃度當Mg2+濃度為1.0 mmol/L時，未見條帶；1.5~3.0 mmo1/L之間均能擴增出較亮、較好的條帶，在2.5 mmo1/L濃度時條帶最清晰。綜合考慮，本試驗Mg2+最適宜濃度為2.5 mmol/L。

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2.5 Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是擴增反應的關(guān)鍵因素，基本反應體系：2.5 μL 10*Buffer, 2.2 μL dNTP, 2.5 μL 1.8 mmol/LMgCl2, 50 ng DNA, 0.4 μL primer, dd H2O 補充至25 μL，T aq DNA聚合酶濃度從高到低共設置5個梯度:0.010，0.020，0.040，0.060，0.070 U/μL即總酶量為5個梯度:0.25，0.50，1.00，1.50，1.75 U。實驗結(jié)果表明(圖5)：Taq DNA聚合酶具有很高的活性，即使在低濃度下(0.25 U)也有擴增結(jié)果，只是條帶稍少且不穩(wěn)定；在高濃度(1.75 U)下帶型豐富，出現(xiàn)模糊現(xiàn)象，而且非特異性產(chǎn)物增多；1.50 U擴增出的條帶多且清晰，故1.5 UTaqDNA聚合酶量最合適。

M: SM0321 Marker

2.6 反應程序?qū)APD擴增的影響

圖6顯示，第1~9泳道都出現(xiàn)了條帶，但條帶不多且亮度比較弱，背景比較模糊，第10~12和第16~18泳道背景適宜，但部分條帶比較弱且亮度不夠，相比之下13~15泳道的條帶多且清晰，這3個泳道中15泳道的條帶最多且背景最清晰、亮度適宜。綜合考慮，第15泳道的反應程序為最佳的反應程序。即預擴增時退火溫度為36 ℃；擴增時退火溫度為40 ℃，延伸時間為60 s。

圖6 反應程序?qū)U增的影響

注: 1~9延伸時間75 s，10~18延伸時間60 s，1~3和10~12預擴增時退火溫度為34 ℃，4~6和13~15預擴增時退火溫度為36 ℃，7~9和16~18預擴增時退火溫度為38 ℃，1、4、7、10、13、16擴增時退火溫度為36 ℃，2、5、8、11、14、17擴增時退火溫度為38 ℃，3、6、9、12、15、18擴增時退火溫度為40 ℃。M: SM0321 Marker

2.7 優(yōu)化的PCR反應體系擴增結(jié)果的穩(wěn)定性

采用優(yōu)化后的RAPD擴增體系對不同株個體DNA進行進行擴增，圖7的擴增結(jié)果表明，該體系在這11株個體材料中均能擴增出清晰的帶型，擴增出的條帶較亮，條帶數(shù)量適宜，且主帶清晰，其中8號為用于RAPD條件優(yōu)化的實驗樣品。

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3 討論

RAPD標記的穩(wěn)定性和可重復性，一直是受人們關(guān)注，這種隨機擴增容易受到其反應體系中各成分含量的影響，所以在進行RAPD分析之前，完全有必要對各因子的反應條件進行優(yōu)化[13]。模板DNA濃度的輕微變化不影響擴增產(chǎn)物的帶型，但擴增的強度略有不同，總體來說DNA濃度可允許在一定范圍內(nèi)變動[14]。本文發(fā)現(xiàn)蛇莓的模板DNA用量在12.5~62.5 ng的范圍內(nèi)均能獲得擴增條帶，用量在50 ng時為最佳；隨機引物與模板DNA的量之間有一種協(xié)同作用，當隨機引物達到一定的濃度時，出現(xiàn)隨機引物爭奪模板DNA的情況，因此必須選擇合適的引物濃度。本試驗設定的引物濃度的范圍相對于范惠玲等人[15]所設定的篩選范圍更小，確定最佳引物濃度為0.4 μmol/L；Mg2+與dNTPs的比例應適當，否則會使擴增產(chǎn)物單鏈化或擴增產(chǎn)物減少導致擴增失敗。張秀英等[16]得出Mg2+較小變動可導致擴增產(chǎn)物較大差異，因此確定Mg2+的濃度也是很關(guān)鍵的；Taq聚合酶在實驗期間不可隨意更換，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的酶得出的條帶數(shù)量和大小均有差異，嚴奉坤等人（2007）也得出類似結(jié)論[17]。

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OPTIMIZATION OF RAPD REACTION SYSTEM IN THE STOLONIFEROUS HERB,

*LIAO Xin-jun, LI Ya-yi, HU Xue-hua

(School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

In order to establish the optimal RAPD reaction system in, every factor in the system was optimized. Based on the RAPD reaction system commonly used in our lab, the optimal RAPD reaction system of genome DNA ofwas determined according to the RAPD amplification effects. The optimal PCR system was as follows: 2.5 μL 10×buffer, 2.0 mmol/L Mg2+, 1.5 U Taq polymerase, 50 ng DNA template, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.35 μmol/L random primer S30 in 25μl reaction system. The results of this paper will lay the basis for assessing the genetic diversity of the wild.

; RAPD; amplification procedure

Q785/Q948.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.008

1674-8085(2013)04-0037-04

2013-03-01；

2013-06-17

井岡山大學科研項目(JZ0821)

*廖信軍(1978-），男，江西吉安人，實驗師，博士生，從事分子遺傳學研究和教學(E-mail：liaoxinjun7811@126.com);

李雅宜(1987-），男，福建龍巖人，井岡山大學生命科學學院本科生(E-mail：liyayi56@126.com);

胡雪華(1977-），女，江西吉安人，實驗師，碩士，主要從事植物學研究(E-mail：huxuehua2008@jgsu.edu.cn ).