淫羊藿苷CaCO3納米微球在大鼠體內(nèi)的血藥濃度監(jiān)測(cè)

王安斌，李群芳，牟方濤，周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

淫羊藿苷CaCO3納米微球在大鼠體內(nèi)的血藥濃度監(jiān)測(cè)

王安斌，李群芳，牟方濤，周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

目的HPLC法監(jiān)測(cè)淫羊藿苷CaCO3納米微球血藥濃度，以評(píng)價(jià)其在大鼠體內(nèi)緩釋效果。方法采用HPLC法測(cè)定大鼠灌胃淫羊藿苷CaCO3納米微球后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血藥濃度。結(jié)果大鼠灌胃200 mg/kg淫羊藿苷CaCO3納米微球后30 min可檢測(cè)到Ica， 60 min后淫羊藿苷開(kāi)始大量釋放，80 min后釋放速度減慢，表明Ica/CaCO3在大鼠體內(nèi)具有良好的緩釋性能。結(jié)論淫羊藿苷以多孔空心納米微球碳酸鈣作為載體，在大鼠體內(nèi)能夠達(dá)到良好的緩釋效果。

淫羊藿苷; CaCO3空心納米微球; 血藥濃度; 緩釋效果

納米藥物，是運(yùn)用納米化制備技術(shù)制備出的一類(lèi)新型藥物，它與傳統(tǒng)藥物相比具有更高的生物利用度，更好的靶向性，溶解性，緩控釋性等優(yōu)點(diǎn)[1]。納米藥物可有效提高藥效，降低不良反應(yīng)，已經(jīng)成為現(xiàn)今國(guó)際醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)[2]。

碳酸鈣納米材料屬于納米氧化物，粒徑在10～100 nm，具有良好的生物相容性、生物降解性、無(wú)毒并且降解速率適宜，在生物學(xué)和醫(yī)藥界中被廣泛的應(yīng)用[3]，曾有報(bào)道利用CaCO3作為載體包載布諾芬(BU)，載藥量可以達(dá)到130 mg/g。藥物釋放100%時(shí)持續(xù)釋放藥物的時(shí)間可達(dá)40 h[4]。本課題組通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將Ica包載到CaCO3發(fā)現(xiàn)載藥率可以達(dá)到45%[5]。體外釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)釋藥時(shí)間可持續(xù)釋放30多小時(shí)，證實(shí)體外有緩慢釋放的效果。那么在體內(nèi)是否也能有緩釋的效果？本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將自制的Ica/CaCO3納米微球?qū)Υ笫蠊辔?，HPLC測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血液中Ica的濃度，與文獻(xiàn)灌胃原型藥物Ica后，Ica的血藥濃度達(dá)峰時(shí)間進(jìn)行比較[6]，以評(píng)價(jià)Ica/CaCO3納米微球在大鼠體內(nèi)的釋放情況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent-1100高效液相色譜儀(Agilent Technologies Co. Ltd)；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；PH酸度計(jì)(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；氮?dú)獯蹈蓛x(北京八方世紀(jì)科技有限公司)；Ica/CaCO3空心微球由實(shí)驗(yàn)室自制[6], 粒徑由透射電鏡測(cè)定約為1 μm。

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量：>98%，批號(hào)：110737-200415)；無(wú)水氯化鈣(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；十二烷基硫酸鈉(分析純，成都化學(xué)試劑廠)；碳酸鈉(分析純，重慶西部化學(xué)試劑廠)；乙腈(色譜純)；無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯均為分析純；去離子水。

1.2 動(dòng)物 Wister大鼠，雌雄不限，體重(400±20)g，遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)，動(dòng)物自由攝食自來(lái)水和普通飼料。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent-EclipseXDB-C18色譜柱(250×4.6 mm, 5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流動(dòng)相：乙腈-水(30∶70)；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：25 ℃[7]。

1.3.2 對(duì)照品的制備 精密稱(chēng)取4.8 mg的淫羊藿苷，置于50 mL的容量瓶中，用甲醇進(jìn)行溶解，定容至刻度得到0.096 mg/mL的溶液。

1.3.3 對(duì)大鼠灌胃后進(jìn)行頸靜脈插管取血 取Wister大鼠12只，取自由飲水條件下，禁食12 h。隨機(jī)分兩組，一組按含200 mg/kg灌胃Ica/CaCO3，另一組做空白。將灌胃好的大鼠，腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，保持其體溫為37 ℃，將頸部一側(cè)鎖骨上方皮膚做2 cm的縱切口，暴露并分離頸靜脈用常規(guī)插管法插入18 cm 長(zhǎng)內(nèi)含生理鹽水的硅膠管(醫(yī)用管，內(nèi)徑0.02 mm，外徑0.037 mm ,USA)，檢查血流通暢后，進(jìn)行固定。于給藥后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min、120 min取血，每次取血0.5 mL于2 mL預(yù)先肝素化的離心管中，離心取上層血漿于2 mL的離心管中，-20 ℃低溫保存，備用。

1.3.4 血漿樣品處理辦法

1.3.4.1 空白血漿及含藥血漿樣品處理 取血漿樣品0.2 mL于2 mL的離心管中，加入1.75 mL乙酸乙酯，振蕩3 min后離心(2 000 r/min時(shí)間：5 min)，取上清液，50 ℃水浴N2吹干，用流動(dòng)相乙腈-水(30∶70)200 μL溶解，再以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即可。

1.3.4.2 空白血漿加對(duì)照品樣品處理 精密吸取一定體積的對(duì)照品溶液，常溫下用N2吹干后精密加入0.2 mL空白血漿，振蕩3 min，加入1.75 mL乙酸乙酯，振蕩3 min后離心(2 000 r/min時(shí)間：5 min)，取上清液，50 ℃水浴N2吹干，用流動(dòng)相乙腈-水(30∶70)200 μL溶解，再以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即為空白血漿加對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果

2.1 HPLC分析方法認(rèn)證

2.1.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別取空白血漿、空白血漿加Ica標(biāo)準(zhǔn)品及Ica/CaCO3灌喂大鼠后的血漿各20 μL，進(jìn)樣，同時(shí)取一份淫羊藿苷對(duì)照品20 μL進(jìn)樣。結(jié)果(見(jiàn)圖1A-D)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照品d圖中Ica的保留時(shí)間為6.703 min。Ica加入空白血漿后及灌胃Ica/CaCO3的大鼠血漿色譜圖響應(yīng)位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰(見(jiàn)圖1B,C)，且空白血漿樣品無(wú)干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 按“1.3.4.2”項(xiàng)下方法操作6份含不同濃度對(duì)照品的空白血漿溶液，20 μL進(jìn)樣分析。以各對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)照品色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：y=19478x-5.0312(mg/mL，r=0.9997)，線性范圍為0.004 8～0.057 6 mg/mL。

注：A:空白血漿;B:空白血漿加Ica;C:灌喂大鼠Ica/CaCO3供試品溶液;D:對(duì)照品Ica。 圖1 HPLC色譜圖

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取Ica濃度為0.038 4 mg/mL的空白血漿溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次, 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，測(cè)得RSD 為1.20 %，結(jié)果表明儀器精密度良好，測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表1)。

表1精密度試驗(yàn)

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下制備空白血漿加對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次間隔1 h，取樣后將樣品置于4 ℃冰箱保存。測(cè)得的Ica峰面積RSD為1.87 %，結(jié)果表明對(duì)照品的空白血漿樣品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 回收率試驗(yàn) 按“1.3.4.2”項(xiàng)下方法操作，制備淫羊藿苷0.0960mg/mL、0.0192mg/mL、0.0384 mg/mL樣品溶液各6份，進(jìn)樣分析得樣品峰面積A1，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算濃度，所得濃度與實(shí)際濃度的比值即為方法回收率；另取純凈水0.2 mL取代血漿，按“2.4.2”項(xiàng)下方法操作，得到與樣品相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工資液，進(jìn)樣分析得峰面積A2，計(jì)算對(duì)照品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積的比值(A1/A2)，即為提取回收率。結(jié)果淫羊藿苷的方法回收率為101.31%、98.90%、95.64%，平均回收率為98.62%，RSD為2.17%；提取回收率為98.37%、102.45%、101.27%，平均回收率為100.70%，RSD為1.93%。

2.2 對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè) 將Wister大鼠灌胃后取出的不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品，按照血漿樣品的處理方法處理后得到不同時(shí)間點(diǎn)10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、80 min、120 min的樣品，按照上述色譜條件，取20 μL進(jìn)行進(jìn)樣分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)峰面積所對(duì)應(yīng)的淫羊藿苷濃度(mg/mL)。并用時(shí)間-血藥濃度來(lái)作圖，可得到藥時(shí)曲線(見(jiàn)圖2)。

圖2 血藥濃度的變化曲線

3 討論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)，建立了HPLC測(cè)定Ica/ CaCO3納米微球的血藥濃度方法，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、靈敏，能滿(mǎn)足生物樣品分析要求，可用于Ica/ CaCO3納米微球的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠灌胃后Ica/ CaCO3納米微球的血藥濃度監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)灌胃后30 min中后可監(jiān)測(cè)到Ica，其后Ica量持續(xù)增加，60 min后Ica釋放速率迅速增大，灌胃80 min后釋放速率減緩。從釋放曲線可看出CaCO3包裹的Ica釋放可分成兩個(gè)階段：第一階段為最初60 min，這個(gè)時(shí)期Ica藥物呈相對(duì)平穩(wěn)、緩慢的釋放，由于它的釋放要通過(guò)CaCO3, 所以釋放比較緩慢；第二階段為60～120 min，這一時(shí)期， CaCO3少量溶解，使CaCO3空心微球空隙增大，Ica 大量釋放。而葉麗卡等[6]曾報(bào)道淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)經(jīng)灌藥后血藥濃度在30 min就達(dá)到了最大，此后進(jìn)入消除階段。比較灌胃Ica/ CaCO3納米微球與直接灌胃Ica，發(fā)現(xiàn)灌胃Ica/ CaCO3納米微球后，發(fā)現(xiàn)達(dá)到最大血藥濃度的時(shí)間延長(zhǎng)，可以讓藥物長(zhǎng)時(shí)間的維持在一個(gè)較高的濃度范圍，同時(shí)證明CaCO3空心微球作為藥物載體時(shí)能明顯地延長(zhǎng)藥物釋放時(shí)間。

通過(guò)對(duì)Ica/CaCO3納米微球在大鼠體內(nèi)的血藥濃度監(jiān)測(cè)的研究，證明該納米制劑可進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，為Ica/CaCO3納米微球在大鼠體內(nèi)的全面藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 楊祥良,徐輝碧,廖明陽(yáng),等.納米藥物安全性[M].北京：科技出版社，2009.

[2]Rosen H,Abribat T.The rise and rise of drug delivery [J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(5):381-385.

[3]李蘇,姜文奇,王安訓(xùn),等.5-FU核殼共聚物納米膠束的制備及其體內(nèi)釋放的研究[J].癌癥,2004,23(4):381-385.

[4]李亮,朱英杰,曹少文,等.碳酸鈣納米結(jié)構(gòu)多孔空心微球的制備及其藥物緩釋性能研究[J].無(wú)機(jī)材料學(xué)報(bào),2009,24(1):166-170.

[5]李群芳,馮學(xué)永,牟方濤,等.淫羊藿苷的CaCO3微球制備及藥物釋放性能研究[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012，35(4):279-282.

[6]葉麗卡,陳濟(jì)民,劉四海，等.淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1999,34(1):33-36.

[7]鄭傳癡,婁方明,陳桂華,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選微波輔助提取淫羊藿中淫羊藿苷的工藝[J].中國(guó)藥房,2010,21(31):2907-2908.

[收稿2013-08-27;修回2013-09-26]

(編輯：譚秀榮)

MonitoringofbloodconcentrationofNanoparticlespreparationincludingIcariinandCaCO3inrats

Wanganbin,Liqunfang,Mufangtao,Zhouxumei

(School of Pharmacy，Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo monitor the blood concentration of icariin CaCO3nanospheres by HPLC and evaluate its prolonged-release efficiency in rats.MethodsThe rats were intragastric administered with icariin CaCO3nanospheres. The blood concentration of different time points were tested by established HPLC.Resultsthe blood concentration of icariin CaCO3appeared at 30 min,released large quantity of Ica after 60 min and released slowly after 80 min, which showed that the Ica/CaCO3has a good sustained-release performance in rats.Conclusionporous hollow nanospheres calcium carbonate is the good carrier for Icariin, which can reach a good sustained release effect.

Icariin; Nano-structured Microspheres;blood concentration, prolonged-realease effect

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(NO:黔科合J字[2010]2214)。

李群芳，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物分析相關(guān)研究，E-mail:slindar809 @126.com。

R927.1

A

1000-2715(2013)06-0525-03