動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)分析方法進(jìn)展

周雪雁，劉翊中，陳軼霞，李 倬，馮玉萍，楊具田

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

動(dòng)物腸道菌群的正式研究是從巴斯德(L.Pasteur)和柯赫(R.Koch)為細(xì)菌學(xué)研究而提出了必不可少的滅菌法與純培養(yǎng)法技術(shù)之后才開(kāi)始的。特別是以柯赫于1881年［1］開(kāi)創(chuàng)的純培養(yǎng)法為開(kāi)端，1885年埃希氏［2］由乳兒糞便中分離出大腸埃希菌，才開(kāi)始了腸道菌群的系統(tǒng)研究。1933年由 Eggerth和 Gagnon［3］明確了腸道厭氧菌問(wèn)題，1957 年由東德的 Haenel［4］、Slanetz and Bartley［5］證明了在人、家畜、家禽腸道菌中厭氧菌占95%以上，最優(yōu)勢(shì)菌是包括乳桿菌或雙叉桿菌在內(nèi)的厭氧菌，完全改變了19世紀(jì)末認(rèn)為大腸埃希菌和腸球菌是優(yōu)勢(shì)菌的看法。進(jìn)而指出在腸道菌叢檢查中必須加用高度厭氧培養(yǎng)法和培養(yǎng)基。1969 年，B.S.Drasar and Margot Shiner［6］大致確立了腸道菌叢檢查法，幾乎所有菌都能用直接涂抹方法培養(yǎng)。以確立這樣的腸道菌叢培養(yǎng)法為開(kāi)端，開(kāi)始了對(duì)人和動(dòng)物腸道菌叢的微生態(tài)學(xué)研究。到目前為止，腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析研究方法主要有以下幾種。

1 傳統(tǒng)的純培養(yǎng)法

在DNA分子技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對(duì)腸道菌群的認(rèn)識(shí)大多數(shù)是靠純培養(yǎng)或靠直接形態(tài)觀察來(lái)獲得部分信息。用純培養(yǎng)方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)，就是通過(guò)對(duì)不同的微生物人為地設(shè)計(jì)多種適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件盡可能分離樣品中所有微生物，進(jìn)而對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和微生物的活性進(jìn)行分析。在最初開(kāi)始微生物生態(tài)學(xué)研究時(shí)，如土壤微生物的研究，這種傳統(tǒng)的分離純培養(yǎng)方法用的最多。分離培養(yǎng)技術(shù)也分析了人體和動(dòng)物腸道內(nèi)定居著的大量微生物。1974年Morre和Holdeman［7］對(duì)20例男性的(地理位置上涵蓋了日本到夏威夷)糞便樣中微生物的種類(lèi)和相對(duì)數(shù)量通過(guò)分離培養(yǎng)法做了統(tǒng)計(jì)分析研究，培養(yǎng)得到了1147個(gè)純培養(yǎng)物，鑒定為3個(gè)不同種的微生物。但這種分離方法，也可能會(huì)漏掉那些數(shù)量很高，但營(yíng)養(yǎng)條件要求苛刻的菌。1989年 Hirayama等［8］和1988年Zhang等［9］也分別用培養(yǎng)的方法對(duì)大熊貓腸道菌群的多樣性進(jìn)行了調(diào)查研究。Zhang等發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群為E.coli而Hirayama等發(fā)現(xiàn)大熊貓腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌為 Streptococcus和Terobacteriaceaee。

事實(shí)上，自然界中，很大一部分細(xì)菌是不能通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)得到純分離物的，原因是有些微生物要求的生長(zhǎng)條件苛刻，有些是絕對(duì)的嚴(yán)格厭氧菌，還有些是在自然環(huán)境中與其他微生物形成共生關(guān)系。實(shí)驗(yàn)室很難模擬自然環(huán)境的條件，因而無(wú)法得到其純培養(yǎng)物。因此，用這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法來(lái)研究某一微生物生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性，必然存在著局限性，不能給出一個(gè)系統(tǒng)中微生物的全貌。而且腸道內(nèi)微生物大多都是厭氧菌，若以這部分能夠被分離培養(yǎng)的微生物來(lái)代表腸道中復(fù)雜的微生物菌群也必將導(dǎo)致極大的偏差?，F(xiàn)在很多學(xué)者利用分子生物學(xué)的手段來(lái)研究微生物生態(tài)系統(tǒng)，然而，無(wú)論分子生物學(xué)的手段如何先進(jìn)，對(duì)自然界微生物的研究，最終仍然希望能夠得到盡可能多的純培養(yǎng)物，在種的水平上詳細(xì)研究其生理生化特征和功能。

2 ERIC(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)-PCR分子雜交技術(shù)

1991 年 Hulton 等［10］首次在 E.coli、Salmonella typhimurium及其他腸道細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了ERIC(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)序列，即腸桿菌基因間保守重復(fù)序列。ERIC實(shí)際上是一對(duì)長(zhǎng)度大于16堿基的引物，ERICPCR是一種“長(zhǎng)引物隨機(jī)PCR技術(shù)”。同年，Versalovic等［11］發(fā)明針對(duì)ERIC序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)，以用于對(duì)細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行指紋圖譜分析，并將該技術(shù)申報(bào)專(zhuān)利。此后，ERIC-PCR技術(shù)就被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌分類(lèi)和菌種鑒別上，也被用來(lái)設(shè)計(jì)專(zhuān)一性的探針和引物用于檢測(cè)環(huán)境和臨床樣品中目標(biāo)菌的存在情況。1999年 Di Giovanni G.D.等［12］用 ERIC-PCR 分析 6 種可培養(yǎng)的純菌組成的混合菌圖譜，獲得了高重復(fù)性的指紋圖譜。2003年潘莉等［13］、2004年 Wei等［14］、2005 年魯海峰等［15］、2007 年徐靈筠等［16］以ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)為手段，分別對(duì)腹瀉兒童、人及仔豬、大熊貓、糖尿病小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)做了比較分析，均獲得了清晰、可重復(fù)的圖譜。

大量研究結(jié)果表明，ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)可成功地分析不同腸道菌群的組成并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)菌群隨時(shí)間或環(huán)境因素影響而變化的過(guò)程，具有快速、重復(fù)性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、選擇性強(qiáng)的缺點(diǎn)，是對(duì)目前已經(jīng)普遍使用的各種16S rDNA基因多樣性分析方法的必要補(bǔ)充。根據(jù)ERIC-PCR指紋圖譜提供的線索，就可以找到一些與功能相關(guān)或有特殊生態(tài)意義的DNA片斷，或在此基礎(chǔ)上結(jié)合群落分子雜交技術(shù)以尋找一些特定微生物群落的“標(biāo)記序列”。

3 基于16S rDNA的分子測(cè)序技術(shù)

16S rDNA的分子測(cè)序技術(shù)主要包括DGGE(denaturing gradient gelelectrophoresis，變性梯度凝膠電泳)，TGGE(溫度梯度凝膠電泳)，16S rDNA克隆文庫(kù)和16S rDNA高通量測(cè)序。

3.1 PCR-DGGE/TGGE

分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的限制，使得微生物學(xué)者可以從基因水平上估計(jì)種的豐度、均度，查明種的變異情況等，從而可以客觀的認(rèn)識(shí)微生物天然的生態(tài)狀況。其中PCR-DGGE/TGGE是近幾年在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用比較廣泛的分子技術(shù)之一，它是基于16S rDNA的可變區(qū)PCR擴(kuò)增子的序列特異性變性濃度/溫度不同進(jìn)行分離的，并且可以檢測(cè)出序列中1個(gè)核苷酸的差異。因此通過(guò)該技術(shù)直接擴(kuò)增16S rDNA的可變區(qū)V3/V6/V8，通過(guò)DGGE構(gòu)建DNA指紋圖譜，建立快速檢測(cè)的分子分型平臺(tái)，每一個(gè)條帶代表某個(gè)微生物優(yōu)勢(shì)菌群，通過(guò)測(cè)序和序列比對(duì)，可以得出此優(yōu)勢(shì)菌群的種類(lèi)，能檢測(cè)到難以或不能培養(yǎng)的微生物，更能精確反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。因此廣泛用于腸道復(fù)雜微生物區(qū)系菌群結(jié)構(gòu)演替和多樣性分析研究，如對(duì)糞便中乳酸桿菌種類(lèi)的分析，服用不同食物(如藥物、益生素等)后腸道菌群的變化等［17］。

3.2 16S rDNA克隆文庫(kù)和16S rDNA高通量測(cè)序法

16S rDNA文庫(kù)是16S rDNA這1542個(gè)堿基遺傳信息通過(guò)克隆載體貯存在一個(gè)受體菌的群體之中，這個(gè)群體就是16S rDNA克隆文庫(kù)。一般通過(guò)構(gòu)建λ噬菌體、Cos質(zhì)粒、YAC人工酵母等方法構(gòu)建。將16S rDNA基因的擴(kuò)增和純化后與載體連接，再轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，通常所構(gòu)建的文庫(kù)只有經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定為含有目的基因片段的陽(yáng)性克隆子才能進(jìn)行測(cè)序。也可以直接采用454平臺(tái)對(duì)16S rDNA-PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序法。將所測(cè)的全部16S rDNA基因序列導(dǎo)入Ribosomal Database project數(shù)據(jù)庫(kù) Chimera Cheek v2.7(http://rdp.cme.msu.edu/cgis/chimera.cgi?su=SSU)進(jìn)行序列分析檢測(cè)，以去除嵌合和錯(cuò)誤序列，再去掉序列中的16S rDNA基因引物及其上下游序列之外的序列，去除載體及引物序列的細(xì)菌16S rDNA基因序列與GenBank及RDP數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌序列進(jìn)行相似性比較分析，從中得到相似高的序列，以鑒定各測(cè)序序列的細(xì)菌所屬類(lèi)型。2009年Husen Zhang等［18］將 16S rDNA-PCR 得到的 184094 個(gè)序列，通過(guò)454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析了6個(gè)肥胖人和3個(gè)正常人的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明盡管人的腸道菌結(jié)構(gòu)十分不同，它們的差異主要集中在6大分支3個(gè)群尤其是厚壁菌門(mén)在正常體重人群中占優(yōu)勢(shì)，而肥胖人在其經(jīng)過(guò)胃時(shí)極度下降，但變形菌門(mén)細(xì)菌有一定比例的上升，產(chǎn)氫普雷沃氏菌科在肥胖人體中高度豐富。

4 熒光原位雜交技術(shù)

自從1995年P(guān) S Langendijk等［19］采用了16S rDNA熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)分析了人糞樣中雙歧桿菌的種屬，1998年A H Franks等［20］分析了人糞樣中細(xì)菌種群的多樣性之后，2000年A Moter等［21］對(duì)熒光原位雜交技術(shù)在使微生物群的可視化研究中的作用進(jìn)行了肯定，該技術(shù)不但對(duì)可培養(yǎng)微生物且對(duì)不可培養(yǎng)微生物也可進(jìn)行探測(cè)。2005年A Swidsinski等［22］采用熒光原位雜交技術(shù)分析了小鼠正常和發(fā)炎腸道菌群的空間結(jié)構(gòu)。目前以16S rDNA為靶序列的寡核苷酸探針熒光原位雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分析環(huán)境中復(fù)雜的微生物群落構(gòu)成。

5 宏基因組學(xué)研究方法

雖然16S rDNA雜交或PCR技術(shù)被廣泛用于微生物多樣性的研究，但這一技術(shù)無(wú)法提供腸道中未培養(yǎng)微生物的遺傳、代謝和生理生化等方面的信息，而宏基因組學(xué)研究可以彌補(bǔ)上述不足。宏基因組是指樣品中全部微生物的基因組，包含了可培養(yǎng)和未培養(yǎng)的微生物基因組，由Handelsman于1998年［23］首次提出。宏基因組學(xué) (又叫元基因組學(xué)，Metagenomics)就是一種以樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和/或測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。在宏基因組學(xué)研究中，借助于大規(guī)模測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)工具，能夠發(fā)現(xiàn)大量過(guò)去無(wú)法得到的未知微生物新基因或新的基因簇，這對(duì)了解胃腸道微生物區(qū)系組成、進(jìn)化歷程和代謝特點(diǎn)，挖掘具有應(yīng)用潛力的新基因具有重要意義。2012年Qin J等［24］采用二階段宏基因組關(guān)聯(lián)研究方法(two-stage MGWAS)通過(guò)基因組高通量測(cè)序研究了來(lái)自中國(guó)的345個(gè)腸道樣本的微生物基因組和組成差異，找到了2型糖尿病在宏基因組學(xué)上的物種分類(lèi)和基因功能標(biāo)記約6000個(gè)。宏基因組學(xué)研究的技術(shù)路線見(jiàn)圖1。

5.1 宏基因組高通量測(cè)序

宏基因組測(cè)序，是對(duì)特定環(huán)境(如動(dòng)物腸道)樣品中的微生物群落基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，以分析微生物群體基因組成及功能，解讀微生物群體的多樣性與豐度，探求微生物與環(huán)境、微生物與宿主之間的關(guān)系，發(fā)掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因組測(cè)序(常用454測(cè)序技術(shù))［25］研究避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的過(guò)程，擴(kuò)展了微生物資源的利用空間，為微生物的研究提供了有效工具。

圖1 宏基因組學(xué)研究的技術(shù)路線Fig.1 The technical route of metagenomics research

5.2 宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及篩選

在宏基因組學(xué)的研究程序中很多是采用構(gòu)建基因組文庫(kù)的路線，克隆DNA到合適的載體，如λ噬菌體，F(xiàn)osmid［26］和 BAC(bacterial artificial chromosome)，再將載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主菌體(大腸埃希菌)便建立了其宏基因組文庫(kù)。在宏基因組學(xué)分析中，靶基因可能只占環(huán)境總基因的很小一部分，因此，必須對(duì)樣品或基因采取富集技術(shù)，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，目前常用的文庫(kù)篩選方法是基于功能驅(qū)動(dòng)篩選法和序列驅(qū)動(dòng)篩選法。

根據(jù)微生物生理和生化特點(diǎn)，可利用選擇性培養(yǎng)基對(duì)樣品富集培養(yǎng)。基因富集能獲得大量高純度DNA，有助于研究特殊微生物群體。如穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP)已被廣泛應(yīng)用于研究參與特殊物質(zhì)代謝的個(gè)別群體;抑制性消減雜交法(SSH)可以選擇性的擴(kuò)增差異表達(dá)目的cDNA片段，同時(shí)抑制非目的cDNA的擴(kuò)增;功能驅(qū)動(dòng)篩選能直接獲得生物活性物質(zhì)，而序列驅(qū)動(dòng)篩選能鑒定酶的可能代替物;底物誘導(dǎo)基因表達(dá)(SIGEX)法(Substrate-induced gene-expression screening method)是利用代謝相關(guān)基因或酶基因往往在有底物存在的條件下才表達(dá)，反之則不表達(dá)，這個(gè)原理來(lái)篩選目的代謝基因。Rees等［27］利用羧甲基纖維素培養(yǎng)基富集培養(yǎng)微生物最終得到了4倍量的纖維素酶基因。Liles等［28］利用16S rDNA探針篩選宏基因組文庫(kù)，從中鑒定了大量未培養(yǎng)耐酸性細(xì)菌。功能驅(qū)動(dòng)篩選方法是利用離心和選擇性篩選培養(yǎng)基，篩選能分解底物的目標(biāo)克隆，鑒定其生化和分子生物學(xué)特征。序列驅(qū)動(dòng)篩選是依賴(lài)于保守序列探針或PCR引物及生物信息學(xué)內(nèi)容進(jìn)行篩選。利用功能驅(qū)動(dòng)篩選方法已從胃腸道中獲得了多種新的抗生素、新水解酶和多酚氧化酶。

5.3 宏基因組文庫(kù)的高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

高通量測(cè)序結(jié)果都是用軟件先進(jìn)行剪輯和歸類(lèi)，然后在數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析。生物信息分析包括標(biāo)準(zhǔn)信息分析和高級(jí)信息分析。標(biāo)準(zhǔn)信息分析要經(jīng)過(guò):①數(shù)據(jù)處理:去除低質(zhì)量Reads、去除接頭序列、去宿主污染;②組裝:組裝和組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)、Contigs長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì);③樣品復(fù)雜度分析:組裝Reads利用率統(tǒng)計(jì)、Kmer統(tǒng)計(jì)與GC-depth分析、將Reads與已測(cè)細(xì)菌基因組與GenBank腸道基因集數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)統(tǒng)計(jì)，能對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)分類(lèi)。MEGAN軟件是目前分析宏基因組數(shù)據(jù)的有效工具。

高級(jí)信息分析也要經(jīng)過(guò)3個(gè)步驟:①物種分類(lèi):將測(cè)序的Reads比對(duì)到已公布的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，鑒定樣品中微生物的種類(lèi)分布、統(tǒng)計(jì)每個(gè)物種分類(lèi)水平的豐度;②功能基因分析:對(duì)Contig≥500 bp的組裝結(jié)果進(jìn)行基因(ORFs)預(yù)測(cè)、功能基因注釋與KEGG、eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)功能集的組成;③多樣品間的比較分析:聚類(lèi)分析(物種、功能)、主成分分析(PCA)、篩選與樣品分組顯著相關(guān)的因子(物種、功能)等;④定制化信息分析:包括目標(biāo)物種的高級(jí)分析(如高豐度物種、關(guān)注物種等);目標(biāo)物種的功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì);目標(biāo)基因的高級(jí)分析(如高豐度基因、關(guān)注基因等);目標(biāo)基因的物種注釋信息統(tǒng)計(jì);目標(biāo)基因的 KEGG代謝通路分析［29］。

16S rDNA測(cè)序技術(shù)是對(duì)16S rDNA的全序列或V3、V6、V8可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析的，可以達(dá)到對(duì)菌群結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化分析的目的，是用于分類(lèi)研究的，而宏基因組學(xué)的方法是對(duì)樣品的總DNA直接進(jìn)行全基因組的宏基因組測(cè)序，可以對(duì)菌群除了進(jìn)行分類(lèi)研究外，還可以做功能基因分析挖掘基因資源，分析與特定環(huán)境相關(guān)的代謝通路，或進(jìn)行樣品間的比較分析，研究微生物與環(huán)境，微生物與宿主，不同環(huán)境間的相互關(guān)系。

6 展望

選擇合理的分析研究方法將有助于正確全面地了解動(dòng)物腸道菌群的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用，有助于充分挖掘其潛在價(jià)值，從而合理利用。對(duì)于動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析方法，經(jīng)歷了從傳統(tǒng)培養(yǎng)方法到現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的過(guò)程，但是至今仍然未能完全詳盡地將腸道菌群結(jié)構(gòu)的種類(lèi)、數(shù)量和功能基因分析清楚，只能達(dá)到一個(gè)宏觀的對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的了解。各種分析方法既具有其優(yōu)越性又存在其局限性，純培養(yǎng)法能分離的菌種和數(shù)量有限，不能反映菌群結(jié)構(gòu)全貌，分子生物學(xué)方法克服了腸道菌因大部分為厭氧菌其培養(yǎng)條件苛刻而很難得到純培養(yǎng)物的缺點(diǎn)，但其得到的是基因序列，只有通過(guò)生物信息學(xué)分析才能推測(cè)出菌群的種類(lèi)和數(shù)量，尤其高通量測(cè)序出來(lái)的基因序列數(shù)量非常龐大，后續(xù)的數(shù)據(jù)分析工作量也很大，耗時(shí)耗錢(qián)，代價(jià)比較大。若將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，將更有利于對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和科研生產(chǎn)需要，有待于開(kāi)發(fā)出更多更有效的分析方法來(lái)推動(dòng)腸道微生物的研究和應(yīng)用。除了文章中闡述的幾種目前常用的分析方法外，2006年Chen Z J等［30］對(duì)高效離子交換色譜分離用于分析動(dòng)物腸道菌群方法進(jìn)行了初探，結(jié)果表明高效離子交換色譜能夠應(yīng)用于腸道菌群這樣的復(fù)雜細(xì)菌體系的分離分析。

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