降解2，6-二叔丁基苯酚菌種的馴化與鑒定

馬海娟

(開朗(上海)生態(tài)科技有限公司，上海 201203)

含酚有機物被廣泛地用于木材防腐劑、防銹劑、殺菌劑和殺蟲劑等，是化工、鋼鐵等工業(yè)廢水的主要有毒成分。其對許多微生物具有抑制毒害作用，在環(huán)境中難以被微生物分解。國內(nèi)外有許多對這類物質(zhì)生物降解研究的報告［1-3］，但對2，6-二叔丁基苯酚(2，6-DTBP)生物降解報道很少［4］。2，6-二叔丁基苯酚是受阻酚類抗氧化劑的主要母體，廣泛用于橡膠、化纖等行業(yè)，同時又是合成醫(yī)藥中間體的重要原料，也可直接用作潤滑油抗氧劑。該物質(zhì)對水中的魚類、藻類和微生物有很大的毒害作用［5］，且難于生物降解［6］。本研究以2，6-二叔丁基苯酚為唯一碳源，通過菌種采集、平板分離純化，初步篩選出對2，6-二叔丁基苯酚有降解作用的菌株。對篩選出的多株菌種進行對底物降解作用的考察，從中選出實驗所用菌種，對其馴化，并進行了形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)的鑒定，以期為高效降解工業(yè)廢水提供優(yōu)良的微生物菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 采自上海某石化腈綸廠廢水處理站的塔式生物濾池和沉淀池水，經(jīng)分離和篩選得到1株能降解2，6-二叔丁基苯酚的M-Z-8菌株。

1.1.2 試驗底物 2，6-二叔丁基苯酚(2，6-DT-BP)，分析純，由北京助劑研究所提供。

1.1.3 萃取劑 正己烷，分析純(≥97.0%)，由中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基 肉湯培養(yǎng)基［7］:牛肉膏5 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 L，pH 7.2(固體培養(yǎng)基另加瓊脂16 g);Bushnell-Hass(B.H.)基礎(chǔ)培養(yǎng)基［8］:MgSO40.2 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO41 g，CaCl20.02 g，K2HPO41 g，F(xiàn)eCl3(60%)2 滴濃縮液，蒸餾水 1 L，pH 7.0。

1.1.5 菌懸液 將32℃下生長24 h的斜面菌種接種到裝有30 mL肉湯培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，在37℃、250 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)24 h。然后將種子液經(jīng)過3次離心(8000 r/min，每次10 min，4 ℃)、2次水洗(用0.85%無菌生理鹽水)，最后用同樣的生理鹽水稀釋成一定濃度(以單位體積的細胞濕重(w/v)表示)的菌懸液。

1.2 方法

1.2.1 馴化及其效果考察 ①菌種馴化:將3 mL濃度為3%的M-Z-8菌株菌懸液接種到含30 mL的B.H.基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角燒瓶中，加入濃度為500 mg/L的2，6-二叔丁基苯酚作為唯一碳源和能源。在37℃、250 r/min的搖床中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基溶液明顯渾濁后，再取上述馴化液3 mL接種到含濃度為500 mg/L的2，6-二叔丁基苯酚的30 mL新鮮B.H.基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繼續(xù)馴化。重復(fù)多次，最后取上述馴化液進行效果實驗;②馴化效果考察方法:分別取未經(jīng)馴化的斜面菌種和4次馴化后的菌液接種到肉湯培養(yǎng)基上增殖，30℃恒溫培養(yǎng)20 h后，制備成3%的菌懸液。再接種1 mL菌懸液到底物濃度為100 mg/L的30 mL B.H.基礎(chǔ)培養(yǎng)基(pH=7.0)中(相當(dāng)于接種量為0.1%)。將未接種和接種的三角瓶置于37℃、250 r/min搖床培養(yǎng)，相隔一定時間取樣，測定2，6-二叔丁基苯酚的濃度變化。

1.2.2 樣品分析 ①檢測條件的確定:采用UV-2201型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)分析2，6-二叔丁基苯酚的濃度變化。通過對不同濃度的樣品掃描，發(fā)現(xiàn)276 nm為2，6-二叔丁基苯酚的紫外特征吸收波長，故選擇在λ=276 nm時測定樣品;②樣品預(yù)處理及分析:在含30 mL樣品溶液的各搖瓶(包括空白對照樣品瓶)中加入10 mL正己烷，振蕩2 min后迅速倒入離心管，4℃、8000 r/min條件下在Sorvall SuperT21離心機上離心8 min，抽取上清液2 mL，于10 mL容量瓶中定容至刻度，276 nm處用紫外-可見分光光度計測定2，6-二叔丁基苯酚的濃度。

1.2.3 菌種的鑒定 主要參照伯杰氏手冊［9-10］和其他相關(guān)的文獻［11-12］，通過形態(tài)和生理生化等特征研究，對本研究所使用的菌種進行鑒定。①菌落特征:在肉湯培養(yǎng)基瓊脂平板上劃線接種，30℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落特征;②菌體形態(tài):菌體涂片后，采用結(jié)晶紫簡單染色法進行染色，然后在光學(xué)顯微鏡下(放大1500倍)觀察菌體形態(tài)、大小。采用革蘭染色法觀察菌株的革蘭染色結(jié)果。通過透射電鏡觀察鞭毛數(shù)量及著生位置等特征。

1.2.4 菌種的16S rDNA序列分析 ①細菌總DNA提取:用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀細胞碎片和多糖，再用異丙醇沉淀提取總DNA;②PCR引物:采用細菌16S rDNA通用引物F27(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和 R1492(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')通過PCR擴增供試菌的16S rDNA片段［13］;③PCR擴增、產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化以及測序:用引物對模板做PCR擴增反應(yīng)，PCR的反應(yīng)體系:10 × PCR Buffer 5 μL，MgCl25 μL，dNTP 1 μL，F(xiàn)27引物 2 μL，R1492 引物 2 μL，Template 0.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 39 μL。反應(yīng)為35個循環(huán)，95℃保溫10 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min;35個循環(huán)后再72℃延伸10 min。凝膠回收試劑盒回收凝膠上的PCR產(chǎn)物，用pMD18-T載體(大連寶生物公司)進行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α的感受態(tài)細胞，然后挑取單克隆至4 mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中37℃、250 r/min培養(yǎng)過夜。在2%的瓊脂糖膠上電泳后，將膠進行染色，紫外燈下觀察，與克隆前PCR產(chǎn)物的大小一致，確定為陽性克隆。將確定為陽性克隆的菌體進行測序;④同源性比較:將測序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的馴化效果

菌種馴化的方式各種各樣，由于菌種對污染物具有一個適應(yīng)的過程，可通過逐漸提高污染物底物濃度的方式，也可直接在高濃度下或通過誘變等方式對菌種進行馴化培養(yǎng)。本實驗采用高濃度情況下對菌種進行馴化，來獲得高活性的2，6-二叔丁基苯酚降解菌種。

圖1所示的結(jié)果表明，未經(jīng)馴化的M-Z-8菌株在12 d的時間里對2，6-二叔丁基苯酚的去除率為40.1%，而經(jīng)過4次馴化后的菌種在相同條件下對底物的平均去除率達到了51.6%，與未馴化菌種相比，經(jīng)馴化后的菌種對100.0 mg/L濃度的底物降解率提高了12%。

圖1 馴化M-Z-8菌株對底物降解的影響Fig.1 The effect of acclimation on 2，6-DTBP degradation by M-Z-8

一般而言，當(dāng)菌種進入到一個新環(huán)境時，對污染物存在著一段時間的適應(yīng)期［14］。在此適應(yīng)期內(nèi)，微生物要通過誘導(dǎo)酶的合成，而且需要合成必需的輔酶或中間代謝物，來達到對污染物的適應(yīng)，這期間對污染物的生物降解速率很小。一旦微生物被馴化，微生物便表現(xiàn)出很高的生物降解能力。在生物降解的后期，可能是由于降解產(chǎn)物的積累導(dǎo)致產(chǎn)生反饋抑制作用，也可能產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物改變了培養(yǎng)液理化性能，或產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)影響菌種生長，造成隨后的降解速率趨于平緩。

2.2 鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征 菌體形態(tài):M-Z-8菌株為革蘭陰性細菌，桿狀，單個或2個存在，大小為(0.3～0.5)μm ×(1.0 ～3.0)μm，極生鞭毛(見圖2)。

圖2 M-Z-8菌株的透射電鏡圖(20000×)Fig.2 TEM of M-Z-8 strain(20000 × )

M-Z-8菌株菌落呈圓形，Φ1.0～2.0 mm，蜜黃色，不透明，表面光滑，濕潤，低凸起，邊緣整齊。

2.2.2 生理生化特征 表1列出了菌株M-Z-8的生理生化特征試驗結(jié)果。

表1 菌株M-Z-8的生理生化特征Table 1 Physiological＆biochemical characteristics of M-Z-8 strain

根據(jù)實驗結(jié)果并結(jié)合文獻資料，確認M-Z-8菌株符合氣單胞菌屬(Aeromonas)的特征，將M-Z-8菌株鑒定為氣單胞菌(Aeromonas sp.)。

2.2.3 16S rDNA序列分析及其同源性比較 以M-Z-8菌株的總DNA為模板，利用對細菌16S rDNA特異的引物F27和R1492進行PCR擴增，得到長約1.5 kb的PCR擴增產(chǎn)物，將獲得的1.5 kb擴增產(chǎn)物進行DNA序列測定，結(jié)果見圖3。

圖3 M-Z-8菌株的16S rDNA核苷酸序列Fig.3 The sequence of 16S rDNA fragment of M-Z-8 strain

用BLAST程序?qū)-Z-8菌株的16S rDNA序列和GenBank中已登錄的16S rDNA序列進行核苷酸同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與多株氣單胞菌種屬的16S rDNA核苷酸序列同源性均在97%以上，其中包括Aeromonas hydrophila、Aeromonas molluscorum、Aeromonas encheleia、Aeromonas eucrenophila、Aeromonas salmonicida 和 Aeromonas popoffii，與生理鑒定結(jié)果吻合，對于其準確的分類地位需要結(jié)合其他的細菌學(xué)手段予以確定。

3 討論

以2，6-二叔丁基苯酚為唯一碳源對初篩得到的菌種進行馴化，獲得了1株對2，6-二叔丁基苯酚有較強降解能力的菌種。該菌株經(jīng)過馴化后，對底物的生物降解能力比未馴化時有所提高，說明其對環(huán)境的適應(yīng)能力有了提高。

通過對菌株進行的形態(tài)學(xué)以及生理生化鑒定，初步表明M-Z-8菌株為氣單胞菌種屬(Aeromonas sp.)。

對M-Z-8菌株的16S rDNA序列進行核苷酸同源性比較，與氣單胞菌種屬的16S rDNA核苷酸序列同源性均在97%以上，包括Aeromonas hydrophila、Aeromonas molluscorum、Aeromonas encheleia、Aeromonas eucrenophila、Aeromonas salmonicida和Aeromonas popoffii。其與生理鑒定結(jié)果相吻合。

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