LC-MS/MS法檢測圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7及其去乙基產(chǎn)物的降解變化

孫其然，羅儀文，向 平，奚建華，楊 旭，徐 徹

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，上海200063）

堿性藍(lán)7（basic blue 7，又名維多利亞藍(lán) BO）是芳基乙烷類堿性染料。堿性藍(lán)7的三苯基乙烷結(jié)構(gòu)（見圖1）不穩(wěn)定，特別在光照條件下，會逐級降解，形成去乙基的降解產(chǎn)物（見圖1）[1]。利用這一特性，可以在一定條件下判斷含堿性藍(lán)7的墨跡（由同種墨水書寫在同一紙張上）的相對形成時間[2]。

圖1 堿性藍(lán)7（分子式C33H40ClN3，分子量514.1438）

相較結(jié)晶紫、甲基紫而言[3-5]，有關(guān)墨跡中堿性藍(lán)7的研究報道較少，大部分文獻都是在建立墨跡中染料的檢測方法時，將堿性藍(lán)7收錄在內(nèi)，用以對圓珠筆或中性筆油墨/墨水進行分類[6-8]。

本研究旨在建立藍(lán)色圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7及其去乙基產(chǎn)物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法（LC-MS/MS），考察含堿性藍(lán)7的圓珠筆油墨墨跡在自然光照、氙燈照射和高溫條件下，堿性藍(lán)7及其去乙基產(chǎn)物的降解變化，尋找藍(lán)色圓珠筆墨跡中隨時間變化的目標(biāo)物，為進一步研究圓珠筆墨跡的書寫時間提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與樣品

堿性藍(lán)7購自TCI東京化成工業(yè)株式會社；乙腈（色譜純）購自美國Sigma公司；50%甲酸購自瑞士Fluka公司；無水乙醇為分析純（宜興市第二化學(xué)試劑廠）。去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得（美國Millipore公司）。

20mM甲酸緩沖液（pH 4）的配制：稱取0.92g 50%的甲酸溶液，用去離子水定容至500mL。

在前期研究的分類基礎(chǔ)上[9]，選取堿性藍(lán)7相對含量較高的9種藍(lán)色圓珠筆制作墨跡樣品進行老化實驗，9種筆的品牌及產(chǎn)地見表1。

表1 9種藍(lán)色圓珠筆品牌及產(chǎn)地

1.2 儀器

Harris micro-punches 0.5mm直徑打孔器（美國Sigma-Aldrich公司）。

SUNTEST CPS+文件老化儀（美國Atlas材料測試技術(shù)公司），配備波長范圍為300～800nm的氙燈。

Waters Acquity超高效液相（美國Waters公司），接API 4000QTRAP四極桿離子阱質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）。Analyst 1.5軟件處理數(shù)據(jù)（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 樣品前處理

用0.5mm直徑打孔器在墨跡上打4個孔，將取下的紙片放入0.5 mL Eppendorf管，加100μL乙腈，超聲20min。提取溶液用乙腈稀釋10倍后，進樣5μL。

1.4 LC-MS/MS條件

液相條件：色譜柱為Waters XBridge C18柱（50mm×2.1mm，5μm），前接Waters Acquity在線過濾器（0.2μm，2.1mm），室溫。流動相為A（20mM甲酸緩沖溶液）∶B（乙腈）=8∶2（v/v）。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離-正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子噴霧電壓（IS）：5500 V；離子源溫度：500 ℃；碰撞氣氮氣（CAD）：Medium；氣簾氣（CUR）：30 psi；離子源氣 1（GS1）：40 psi；離子源氣 2（GS2）：50 psi。

1.5 堿性藍(lán)7的去乙基產(chǎn)物及其特征性離子對

取堿性藍(lán)7標(biāo)準(zhǔn)品適量，用無水乙醇溶解，涂抹于干凈的載玻片上，待溶劑揮發(fā)后，將載玻片放入文件老化儀中，以750W/m2的輻照強度照射4h后，取出載玻片，用手術(shù)刀片刮下適量樣品，用乙腈溶解、稀釋。在ESI+模式下，流動注射進樣。按照分子量找到堿性藍(lán)7降解產(chǎn)物的分子離子峰（本文中所指堿性藍(lán)7及其去乙基產(chǎn)物的分子離子峰、母離子、子離子均指不含氯離子的陽離子化合物，下同），并進一步獲取它們的二級質(zhì)譜圖，以各目標(biāo)物的分子離子峰為母離子，豐度較強的兩個碎片離子為子離子，同時優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），最終每個目標(biāo)物選定兩對母離子/子離子對，其中第一對離子對用于半定量。

1.6 重現(xiàn)性考察

取5號圓珠筆作為代表，在80g的A4紙（史泰博）上劃線，按1.3項下平行制備8份樣品。

另用打孔器取樣1份，加100μL乙腈，超聲20min。然后各取20μL提取溶液，分別用乙腈稀釋至100μL、200μL和 400μL。 各進樣 5μL進行檢測。

1.7 自然光照老化

取9支圓珠筆，在A4紙上劃線。一組懸掛于室內(nèi)朝西方向玻璃窗上，接受自然光照；另一組作為對照，放在室內(nèi)抽屜中避光保存。制樣后即取樣（n=2），之后每周取樣一次，持續(xù)3個月（2010.05.29～2010.08.28）。

1.8 高溫老化

取一張A4紙，依次用2號、7號和8號圓珠筆劃線，如是制作2張。然后將2張紙各用烘箱避光加熱60h，加熱溫度分別為50℃和100℃。每隔12h取樣（n=3），持續(xù) 60h。

1.9 氙燈老化

取一張A4紙，依次用2號、7號和8號圓珠筆劃線，如是制作6張。然后將6張紙依次放入文件老化儀中各老化 5h，輻照強度分別為 750 W/m2、650 W/m2、550 W/m2、450 W/m2、350 W/m2和 250 W/m2， 老化溫度恒定為50℃。老化前和老化后各取一次樣（n=3）。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿性藍(lán)7及其去乙基產(chǎn)物的特征性離子對

堿性藍(lán)7經(jīng)過氙燈輻照4h，溶解進樣后得到如圖2的全掃描質(zhì)譜圖。其中m/z 478是堿性藍(lán)7的[M]+峰，m/z 450、 m/z 422、m/z 394、m/z366 和 m/z 338 等是堿性藍(lán)7的去乙基產(chǎn)物，它們之間分子量的級差為28D a。

圖2 堿性藍(lán)7老化4h后的一級全掃描質(zhì)譜圖

對這些離子進一步轟擊，獲得它們的二級質(zhì)譜圖，根據(jù)目標(biāo)物的碎片離子信息，每個目標(biāo)物選擇兩對母離子/子離子對，建立MRM方法。各目標(biāo)物的LC-MS/MS參數(shù)見表2。

為了消除圓珠筆墨跡分布不均對分析結(jié)果的影響，本研究采用用相對峰面積來對各組分進行半定量（i表示母離子質(zhì)荷比為i的目標(biāo)物，峰面積是指其特征離子對的響應(yīng)峰面積）。

2.2 重現(xiàn)性考察結(jié)果

8份相同濃度的平行樣本中堿性藍(lán)7的相對含量值的RSD（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）為0.1%；稀釋至三個不同濃度的樣品中堿性藍(lán)7的相對含量值的RSD為0.2%，這些結(jié)果表明方法能用于分析書寫在紙上、油墨分布不均勻的墨跡樣品中的目標(biāo)物。

表2 堿性藍(lán)7及其去乙基產(chǎn)物的LC-MS/MS參數(shù)

2.3 自然光照老化結(jié)果

經(jīng)過三個月的自然光照，紙上的藍(lán)色圓珠筆墨跡逐漸褪色。9種圓珠筆油墨中堿性藍(lán)7的降解速度不同：1號至4號、6號和7號6種圓珠筆墨跡中的堿性藍(lán)7的降解速度較為接近；而5號、8號和9號圓珠筆墨跡降解較快。9種圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7的相對峰面積減少了52.9%～97.9%；E4的相對峰面積變化了-1.0%～5.8%；E3的相對峰面積增加了 18.7%～41.7%；E2、E1和E0的相對峰面積分別增加了11.1%～78.5%、1.7%～7.4%、5.1%～14.8%。

2.3.1 堿性藍(lán)7的降解變化

在3個月內(nèi)，9種圓珠筆墨跡中的堿性藍(lán)7的相對含量隨時間逐漸減少。根據(jù)SPSS 17.0軟件的回歸分析結(jié)果，7種圓珠筆墨跡中的堿性藍(lán)7老化曲線和指數(shù)函數(shù)最接近，剩余2種圓珠筆墨跡中的堿性藍(lán)7降解較快，其老化曲線更接近直線（見表3）。

盡管9種圓珠筆的墨跡樣品是書寫在同一張紙上，且這些油墨中的堿性藍(lán)7具有接近的初始相對峰面積值，但是它們的老化曲線都不相同。這表明堿性藍(lán)7的降解反應(yīng)會受到圓珠筆油墨配方中其它成分的影響。

值得注意的是1號、2號、3號和4號的擬合曲線非常接近（見圖3）。這四種圓珠筆同為豐華牌，只是型號不同，因此它們的油墨配方可能相近。

圖3 1號、2號、3號和4號圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7的擬合老化曲線

2.3.2 E4的降解變化

E4豐度最大的子離子是m/z406，但由于m/z450→406的離子對在檢測實際老化樣品時有干擾峰，所以E4的定量離子對選的是豐度較低、但沒有明顯干擾峰的m/z450→377。較低的豐度使原本在堿性藍(lán)7降解鏈中處于上游的E4在定量時所占的相對含量較低。就E4本身來看，在光照條件下，其相對峰面積隨時間呈現(xiàn)出先增加后減少的變化趨勢。用SPSS 17.0軟件進行回歸分析，E4隨時間變化的趨勢最接近二次函數(shù)，擬合曲線見表4。1號、2號、3號和4號樣品的擬合曲線較為接近。

表3 9種圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7隨時間變化的經(jīng)驗公式

2.3.3 E3的降解變化

除了6號和8號樣品中的E3在3個月內(nèi)一直增加以外，其余7種圓珠筆墨跡中的E3的相對含量都先增加后減少。用SPSS 17.0軟件進行回歸分析，E3隨時間變化的趨勢最接近二次函數(shù)，擬合曲線見表5。1號、2號、3號和4號樣品的擬合曲線較為接近。

2.3.4 E2、E1和E0的降解變化

3個月內(nèi)，E2的相對峰面積持續(xù)增加。8號和9號油墨樣品的降解較快，它們E2的相對峰面積分別增加至55.8%和78.5%。其余7種油墨樣品中E2相對峰面積增加了11.1%～16.7%。

E1和E0是最后兩級降解產(chǎn)物，因而出現(xiàn)較晚，對于褪色較快的8號和9號圓珠筆樣品，沒有檢出E1和E0。在檢出的所有樣品中，這兩個降解產(chǎn)物的相對峰面積持續(xù)增加，增長范圍分別為4.7%～7.4%和5.1%～14.8%。

2.3.5 對照組檢測結(jié)果

在本實驗中，除了自然光照組外，還設(shè)置了對照組。對照組樣品的分析結(jié)果表明，在常溫、避光的條件下保存3個月，9種圓珠筆墨跡中的堿性藍(lán)7的相對比例幾乎不發(fā)生變化，它們相對含量的RSD值均不大于0.3%，表明常溫、避光條件下保存的圓珠筆墨跡，其中的堿性藍(lán)7較為穩(wěn)定。

2.4 高溫老化

由于進行自然光照老化實驗時，觀測到樣品周圍的最高環(huán)境溫度約為50℃，為了考察高溫對堿性藍(lán)7降解的影響，選取2號、7號和8號圓珠筆分別在50℃和100℃下避光加熱60h，檢測結(jié)果表明：即使在100℃，這些樣品中的堿性藍(lán)7降解量也都非常有限：變化最明顯的7號樣品中堿性藍(lán)7的降解量約為1.6%。該結(jié)果說明溫度對墨跡中堿性藍(lán)7的降解的影響可以忽略不計。

2.5 氙燈老化

2號、7號和8號圓珠筆墨跡在文件老化儀中用6個不同的輻照強度分別照射5h，各樣品中的堿性藍(lán)7都發(fā)生降解，而且降解量隨輻照能量的增加而增加；與此同時，E4～E2的相對含量不斷增加。相比三個月的自然光照老化，氙燈老化的實驗條件較為溫和，因此無論在老化前還是用750W/m2的最大輻照強度老化5h后，各樣品中都沒有檢出降解產(chǎn)物E1和E0；3種圓珠筆墨跡中E2的相對峰面積分別增加了0.28%、1.19% 、2.91%。3種圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7、E4和E3隨輻照能量變化的擬合曲線見表6至表8。

和自然光照老化實驗相比，氙燈老化實驗中，樣品箱內(nèi)的溫度恒定（50℃），總的輻照能量可控，因此得到的老化曲線主要描述了光輻照能量對堿性藍(lán)7降解的影響。2號、7號和8號圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7的老化曲線都可擬合成指數(shù)函數(shù)，而E4、E3都可擬合成二次函數(shù)，這一結(jié)論與自然光照老化實驗的結(jié)論一致。

表4 9種圓珠筆墨跡中E4的老化曲線模型

表5 9種圓珠筆墨跡中E3的老化曲線模型

表6 3種圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7的擬合曲線模型

在堿性藍(lán)7的5個去乙基產(chǎn)物中，只有E4（根據(jù)不同的離子源，m/z為450或448）由Ifa,Denman和Gallidabino[6,8,10]報道過，而本研究建立了同時檢測堿性藍(lán)7及其5個去乙基產(chǎn)物的MRM方法，為可疑文件上含堿性藍(lán)7的墨跡檢驗提供了新的鑒別方法，也為進一步研究圓珠筆墨跡中堿性藍(lán)7的降解變化與書寫時間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。

影響染料老化行為的因素很多，如初始的染料濃度、墨水配方、光輻照度和波長，濕度，等各種內(nèi)外環(huán)境因素[12]，通過建立堿性藍(lán)7及其去乙基產(chǎn)物的人工老化曲線，并研究不同的油墨配方和溫度的影響，本研究初步刻畫了堿性藍(lán)7的降解變化。有關(guān)不同貯存條件下堿性藍(lán)7的自然老化過程、堿性藍(lán)7和油墨配方中其它成分之間的具體相互作用等，有待進一步的研究。

表7 3種圓珠筆墨跡中E4的擬合曲線模型

表8 3種圓珠筆墨跡中E3的擬合曲線模型

3 結(jié)論

本研究建立了堿性藍(lán)7及其5個去乙基產(chǎn)物的LC-MS/MS方法，通過對9支圓珠筆墨跡樣品進行自然光照老化實驗，得到：在光照條件下堿性藍(lán)7的相對含量不斷下降，其去乙基產(chǎn)物E4和E3的相對含量依次達到峰值后下降，E2、E1和E0的相對含量持續(xù)增加。進一步進行氙燈老化實驗，結(jié)果表明：堿性藍(lán)7的相對含量和光的輻照能量之間成指數(shù)函數(shù)關(guān)系，而其降解產(chǎn)物E4、E3的相對含量和光的輻照能量成二次函數(shù)關(guān)系。堿性藍(lán)7的降解受油墨配方的影響，而溫度的影響可以忽略。

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