吸毒者頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虻姆治黾霸u(píng)價(jià)

向 平，孫英英，沈保華，沈 敏

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

1 引言

濫用藥物毛發(fā)分析已逐漸應(yīng)用于法醫(yī)和臨床毒物分析領(lǐng)域[1-2]。與傳統(tǒng)的血液、尿液等生物檢材相比，毛發(fā)分析的突出優(yōu)點(diǎn)在于其檢測(cè)時(shí)限長(zhǎng)，根據(jù)頭發(fā)的長(zhǎng)度可反映幾周至幾個(gè)月的用藥情況，而尿液分析的檢測(cè)時(shí)限僅為幾天。

海洛因吸毒是我國(guó)的一個(gè)嚴(yán)重社會(huì)問(wèn)題[3-4]。海洛因進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)肝臟迅速去乙?；纬?-單乙酰嗎啡，然后進(jìn)一步代謝成嗎啡[5]。但是，尿液中檢出的嗎啡成分也可能是由服用某些臨床藥物或者鴉片類(lèi)產(chǎn)品引起，因此，尿液中嗎啡陽(yáng)性結(jié)果的解釋與判定是毒物分析領(lǐng)域的一個(gè)難題[1]。

尿液中嗎啡陽(yáng)性的結(jié)果解釋可通過(guò)毛發(fā)分析加以解決[1，6]，因?yàn)槊l(fā)中阿片類(lèi)藥物原型及其代謝物的濃度及其比率可用于區(qū)分海洛因吸毒者和其它嗎啡類(lèi)生物堿的接觸者，也可以區(qū)分主動(dòng)吸食和被動(dòng)污染。6-單乙酰嗎啡是海洛因的主要活性代謝物，是海洛因吸毒的體內(nèi)標(biāo)志物。乙酰可待因是海洛因合成過(guò)程的雜質(zhì)成分，有報(bào)道建議將其作為海洛因吸毒的特殊標(biāo)志物[7]。但迄今，還缺少我國(guó)吸毒人群頭發(fā)中阿片類(lèi)藥物成分的分布信息。

國(guó)際毛發(fā)分析協(xié)會(huì) （The Society of Hair Testing，SOHT）[8]建議，區(qū)分海洛因吸毒與可待因或嗎啡類(lèi)使用者時(shí)，毛發(fā)中6-單乙酰嗎啡濃度的閾值（cutoff）為0.2 ng/mg，同時(shí)，吸毒者毛發(fā)中6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率應(yīng)大于1.3。但是，毛發(fā)分析中一個(gè)很重要的問(wèn)題是如何使包埋于毛發(fā)基質(zhì)中的目標(biāo)物釋放出來(lái)。采用通常的毛發(fā)前處理過(guò)程如酸或堿水解孵化，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的6-單乙酰嗎啡很容易分解成嗎啡，乙?？纱蚩赡芊纸鉃榭纱颍倚枰^(guò)夜，費(fèi)時(shí)，由此可能造成不同的毛發(fā)樣品前處理過(guò)程產(chǎn)生不同的阿片類(lèi)藥物分布規(guī)律。冷凍研磨是一種新型的樣品前處理方法，將樣品在液氮溫度下粉碎，主要應(yīng)用于生命科學(xué)等領(lǐng)域。采用冷凍研磨處理毛發(fā)樣品可有效地減少性質(zhì)不穩(wěn)定的6-單乙酰嗎啡和乙酰可待因的分解。

本研究將采用冷凍研磨處理頭發(fā)樣品，考察50例海洛因吸毒者頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虻臐舛?，與其它非中國(guó)吸毒人群的毛發(fā)分析結(jié)果比較，并進(jìn)一步考察SOHT建議的6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率區(qū)分方法的可行性。

2 材料與方法

2.1 試劑

海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因、乙?？纱?、同位素內(nèi)標(biāo)6-單乙酰嗎啡-d6和嗎啡-d3對(duì)照品（濃度1.0 mg/mL）均購(gòu)自美國(guó)Cerilliant公司。甲醇、乙腈、氯仿和異丙醇購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司，甲酸和乙酸銨購(gòu)自瑞士Fluka公司，其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)制備。

2.2 頭發(fā)樣品

50份海洛因吸毒者陽(yáng)性頭發(fā)來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室2010～2012年間受理的涉毒鑒定案例。貼根采取海洛因吸毒者頭頂部3cm頭發(fā)段（黑色），標(biāo)注后室溫保存。

空白頭發(fā)來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室工作人員，沒(méi)有阿片類(lèi)藥物接觸史。

2.3 樣品前處理過(guò)程

按照已建立的方法[9]，首先進(jìn)行去污處理，頭發(fā)樣品置具塞試管中，依次用0.1%洗潔精2mL、去離子水和二氯甲烷各清洗兩次，最后一次清洗液留存、分析。取出頭發(fā)晾干，用剪刀剪成約1～2mm段。將剪碎的頭發(fā)段和撞子裝入冷凍研磨樣品瓶，密封后將樣品瓶浸入液氮中，撞子在磁場(chǎng)作用下反復(fù)沖撞將樣品粉碎。稱(chēng)取冷凍研磨后的頭發(fā)粉末20mg，置于10mL具塞玻璃試管中，加入10μL混合內(nèi)標(biāo)6-單乙酰嗎啡-d6和嗎啡-d3溶液（0.4μg/mL）和 pH9.2硼酸緩沖溶液2mL，超聲 30min。然后加入氯仿-異丙醇（9：1）混合液 2mL 渦旋混合，離心（1437×g）3min，轉(zhuǎn)移下層有機(jī)相，于空氣流下吹干。殘余物中加入乙腈-20mM乙酸銨（80∶20， v/v）流動(dòng)相溶液 100μL 復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣管中，取5μL進(jìn)樣。

2.4 LC-MS/MS分析

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）系統(tǒng)包括API 4000 QTRAP串聯(lián)四極桿線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀 （美國(guó)Applied Biosystems公司）和 AcquityTM Ultra Performance LC超高壓液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），由Analyst 1.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

色譜柱為Resteck Allure PFP丙基柱（100mm×2.1mm，5μm），流動(dòng)相：A 為 20mmol/L 乙酸銨和 0.1%甲酸緩沖溶液，B為乙腈，流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1；恒流：250μL/min。

質(zhì)譜檢測(cè)為電噴霧離子源正離子模式（ESI+），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)。離子噴霧電壓（IS）：5500V；離子源溫度（TEM）：450℃；碰撞氣氮?dú)猓–AD）：7psi；氣簾氣（CUR）：10psi；霧化氣（GS1）：20psi；輔助氣（GS2）：40psi。

表1 UPLC梯度洗脫程序

所建方法經(jīng)驗(yàn)證，頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虻淖畹蜋z出限 （LOD）在0.005～0.02 ng/mg 范圍，最低定量限（LOQ）在 0.01～0.05 ng/mg范圍。方法的提取回收率在 47.2%～110%，日內(nèi)和日間精密度的變異系數(shù)小于14%。

3 結(jié)果與討論

海洛因、6-單乙酰嗎啡等一些化合物在樣品前處理過(guò)程中不穩(wěn)定[10]，易分解。已有的研究表明，甲醇提取效果好，是海洛因吸毒頭發(fā)鑒定的推薦方法，但是，該方法至少需要超聲2h以上，費(fèi)時(shí)，難以滿(mǎn)足我國(guó)公安機(jī)關(guān)拘留24h內(nèi)必須做出決定的要求，所以，迫切需要研發(fā)冷凍研磨這種快速前處理技術(shù)。我們之前的研究中[9]，考察了不同樣品前處理過(guò)程中海洛因和6-單乙酰嗎啡的穩(wěn)定性（見(jiàn)表2）。盡管在緩沖液超聲時(shí)有部分6-單乙酰嗎啡降解為嗎啡，但由于超聲時(shí)間短，應(yīng)用方法1降解程度較低（29.6%），同時(shí)，采用本方法海洛因降解不超過(guò)6%[9]。

表2 不同樣品前處理方法比較

50例吸毒者的頭發(fā)樣品經(jīng)所建的LC-MS/MS方法分析[9]，結(jié)果見(jiàn)表3，其中均檢出6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虺煞?，僅有2個(gè)樣品中未檢出海洛因成分。頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虻臐舛染捣謩e為1.83（范圍0.02～12.20）、5.36 （范圍 0.20～52.90）、2.42（范圍 0.11～10.30）、 6.07（范圍 0.25～55.60）和 0.58（范圍 0.05～3.99）ng/mg。

表3 吸毒者頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虻臐舛?（ng/mg）

所有樣品中僅2個(gè)中海洛因的濃度最高，這主要是由于個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣，在日常的洗發(fā)過(guò)程中，海洛因可降解為6-單乙酰嗎啡，6-單乙酰嗎啡繼續(xù)降解為嗎啡。有2個(gè)樣品中未檢出海洛因，這與Kintz等[10]采用甲醇浸泡的檢出率90%相近，但另一些報(bào)道中海洛因的檢出率較低，如 14%[11]、27%[12]、35%[13]和50%[14]。

毛發(fā)分析時(shí)排除外污染干擾是確保結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，通?？蛇M(jìn)行三個(gè)步驟。首先，毛發(fā)樣品處理前需要清洗，再者，分析時(shí)同時(shí)檢測(cè)相應(yīng)的代謝物，最后在結(jié)果分析時(shí)根據(jù)cutoff值[15]。在本研究中，按照Tsanaclis[15]的建議，頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡和嗎啡的濃度遠(yuǎn)超過(guò)最后一次清洗液中濃度10倍以上。海洛因的體內(nèi)主要代謝物6-單乙酰嗎啡和嗎啡出現(xiàn)在所有頭發(fā)樣品中，并且，6-單乙酰嗎啡濃度高于SOHT 建議的 cutoff值（0.2 ng/mg）。

與其它研究[16-18]相比較，頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虻臐舛葻o(wú)明顯差異。在20例海洛因吸毒者頭發(fā)中中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡和可待因的濃度均值分別為0.17、0.90、0.26和 0.18 ng/mg[16]；另一報(bào)道中，82個(gè)頭發(fā)樣品中6-單乙酰嗎啡和嗎啡的濃度中值分別為3.2（范圍 0.1～154.1）和 2.1 （范圍 0.1～36.3） ng/mg[17]；Tsanaclis[18]調(diào)查英國(guó)本土上藥物濫用狀況，吸毒者頭發(fā)中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙?？纱虻淖罡邼舛确謩e為 146.4、220.8、 291.3、68.4 和 40.3 ng/mg。

海洛因吸毒程度可通過(guò)頭發(fā)中6-單乙酰嗎啡的濃度加以劃分[1]，Pépin[19]建議分為低、中和高三檔，按照此建議，本研究中50例吸毒程度的分布情況見(jiàn)圖1，吸毒習(xí)慣以每周或每天1次為主。當(dāng)然，這種劃分是相對(duì)的，因?yàn)楹芏嘁蛩乜捎绊懰幬镞M(jìn)入毛發(fā)的量，例如毒品純度、吸毒次數(shù)、吸毒者的毛發(fā)顏色、藥物進(jìn)入毛發(fā)的速率等，個(gè)體在藥物代謝和頭發(fā)護(hù)理、衛(wèi)生習(xí)慣等都存在差異。

圖 1 本研究結(jié)果按照Pépin[19]建議的吸毒程度分布情況

表4 本研究6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率與其它研究的比較

海洛因吸毒毛發(fā)分析時(shí)一個(gè)很重要的問(wèn)題是樣品前處理時(shí)6-單乙酰嗎啡在酸、堿條件下可能分解為嗎啡，因此，不同的樣品前處理方法可能造成不同的定量結(jié)果，使分析的結(jié)果解釋變得復(fù)雜化。本研究中，頭發(fā)樣品采用冷凍研磨粉碎、緩沖液（pH 9.2）中超聲30min的方法有效地減小了6-單乙酰嗎啡的分解。50例頭發(fā)樣品中6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率在0.15～36.27，大約28%的樣品中濃度比率低于1.3，超出了SOHT的建議值。并且，與已有的研究報(bào)道[17，20-23]相比，見(jiàn)表4，本研究中比率的最大值相對(duì)非常高。造成此差異的原因可能基于樣品前處理方法、個(gè)體在毒品成分、劑量、代謝、頭發(fā)顏色、吸毒習(xí)慣等方面的差異。有報(bào)道[20-23]認(rèn)為該比率不能作為唯一決定性的判斷指標(biāo)，對(duì)比率落在SOHT建議值之外的樣品要慎重判斷，也有認(rèn)為該比率應(yīng)根據(jù)分析方法進(jìn)行修訂。基于本研究結(jié)果，作者認(rèn)為頭發(fā)樣品中6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率存在如此大的差異，難以作為判斷海洛因吸毒的指標(biāo)。

乙酰可待因?yàn)楹Ｂ逡蚝铣蛇^(guò)程中的雜質(zhì)成分，其濃度隨合成路線(xiàn)不同存在很大差異。本研究中，所有樣品中均可檢出乙?？纱?，平均濃度為0.58ng/mg（范圍： 0.05～3.99ng/mg）。 但是，我們同意 Kintz 的建議[7]，與6-單乙酰嗎啡相比，由于其濃度低、差異大，乙酰可待因難以替代6-單乙酰嗎啡作為海洛因吸毒的判斷指標(biāo)。

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